3D多元类器官药物筛选芯片的设计、构建及应用

发布时间：2019-03-05 20:17

【摘要】：在药物研发过程中,细胞水平测试是不可缺少的重要环节。传统的孔板细胞平台过于简陋,只是使细胞静态地暴露于药物溶液中,忽略了细胞外微环境,更没有涉及药物在体内吸收、分布、代谢和消除的特性,实验结果可靠性极低,参考意义有限。微流控芯片内单元构件的尺度使它有可能同时容纳分子,细胞,组织,甚至器官,而芯片特殊的流体精准操控体系又使它能同时测量物理量,化学量和生物量,兼有体积小、消耗低、高通量等优点,被视为取代孔板的理想平台。目前已报道的用于药物筛选的微流控装置多为将不同组织来源的细胞进行二维串、并联,尚未考虑药物跨膜的过程,更没有大量实际药物测试数据支撑,仍处于概念阶段。针对于已有药物筛选芯片的不足,依据口服药物的吸收代谢流程,本论文设计并构建了一个立体多层(3D),集成多种细胞屏障(多元),具有多功能的微流控类器官药物筛选芯片,用以在体外模拟药物经过口服后的吸收、分布、代谢和消除的过程。芯片从上至下依次集成了结肠癌细胞系(Caco-2)、人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)、SD大鼠原代肝实质细胞、HUVEC,人乳腺癌细胞系MCF-7、SD大鼠心脏、肺、脂肪组织和透析膜,此排列顺序依照药物在肠道被肠上皮绒毛吸收后,穿过毛细血管进入血液,由肝门静脉汇入肝脏,经心脏输送至全身,跨出毛细血管到达各个组织,最后经肾脏排出的过程而设置。论文第一部分描述了芯片的设计及构建,并对可行性进行了验证。首先,分别考察了3D多元类器官芯片中各生物单元的功能。其次,利用荧光素钠、普萘洛尔和葡聚糖的透过实验,确立了Caco-2和HUVEC细胞层的功能性以及芯片的密封性。随后,利用环磷酰胺验证了SD大鼠肝实质细胞层的代谢能力。最后,通过染色鉴定了芯片中心脏、肺和脂肪组织的活性维持。第二部分描述了3D多元类器官芯片在药物研发中的应用。包括普萘洛尔和戊巴比妥在心脏、肺和脂肪组织中的分布;环磷酰胺,紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B对MCF-7细胞的抑制作用；对乙酰氨基酚、普萘洛尔、环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B引发的肝细胞损伤；普萘洛尔、硫喷妥钠、戊巴比妥和埃博霉素B在循环培养液中的浓度变化。多种经典药物的芯片测试结果与文献报道的动物实验结果具有相同的趋势物,由此证明,相对于传统细胞平台,此基于微流控技术的多元3D芯片更适合于前期药物筛选,其测试结果对随后的体内实验具有一定的参考价值,可能有效提高药物筛选的效率。第三部分对在3D多元类器官芯片测试中展现出优秀抗肿瘤药效的埃博霉素B的作用机制作了进一步探讨。实验发现,作为微管蛋白稳定剂的埃博霉素B衍生物UTD1,在不同浓度下可使MCF-7和HT29细胞产生不同的状态：高浓度(800 nM)的UTD1能阻止有丝分裂,使细胞停滞于G2/M期,此时p21和Bax蛋白水平无显著变换,但P53蛋白水平上调,且定位于细胞质中,caspase 7酶原被激活,证明此时细胞凋亡机制启动；而在较低浓度(50 nM)时,UTD1诱导MCF-7和HT29细胞形成非整倍体并产生细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞中检测到p21蛋白水平上调,而Bax和P53蛋白水平无显著变化,但P53蛋白转录活性上调,说明P53转录活性提高并不依赖于蛋白水平的积累；P53蛋白在相同药物带来的不同细胞压力下发挥出截然相反的作用,促进被阻滞于G2/M期的细胞凋亡,而尝试维持被阻滞于Go/G1期的细胞存活,这对于癌症的治疗可能不利。本文设计并构建的微流控3D多元类器官药物筛选芯片,可用以在体外测试药物的ADME特性、肝细胞毒性和抗肿瘤活性试验,其结果与动物实验具有相同趋势的结果,完全优于现有的细胞实验平台,证明了它所具有的用于药物前期初筛的可行性和价值,为“人体芯片”最终完全取代替代细胞实验提供了新的思路和新的数据支持；根据芯片试验结果,进一步研究埃博霉素B的抗肿瘤机制,提出并证明了不同程度的微管解聚紊乱导致P53蛋白做出的不同决策并产生截然相反的下游信号应答,此结果有助于为进一步了解P53蛋白及其相关复杂信号通路,并推测低浓度微管紊乱剂作用下P53蛋白可能会影响化疗效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R917

【相似文献】