生物膜—硅纳米孔阵列光学传感器及药物筛选系统的构建

发布时间：2019-03-10 21:53

【摘要】：生物膜系统具有阻挡外源伤害,维持生命活动稳定、有序进行的功能。生物膜系统作为生物体的外层结构,为生命活动的进行提供必要的能量、信息、物质的交换。生物膜系统的选择性通透能力为生物体提供交换途径的同时也起到保护作用。对于作用靶点在胞内的药物,其发挥作用的先决条件是要穿透细胞膜进入细胞内。然而生物膜的屏障作用阻止了许多药物的渗透,从而很大程度上限制了这类药物分子的生物利用率。因而,生物膜渗透能力成为药物筛选的重要研究内容。近三十年间,生物膜系统的功能性与药物渗透性研究由复杂的体内实验逐渐发展到体外实验。体外模型涵盖了计算机模拟、分子水平、人工膜水平、细胞水平、组织水平实验等诸多方式。然而在渗透性检测方法上的突破十分有限,目前的研究报道大多基于荧光标记、电学信号检测等模式。然而部分荧光标记分子对细胞功能可能具有一定的影响,且荧光修饰改变了药物分子的原有结构,难以在接近真实环境中进行药物渗透能力的检测。电学信号检测的芯片结构和设备较为复杂,电极容易受到污染,方法重现性较差。为克服现有研究方法的缺点,本论文旨在建立一种非标记光学检测方法,用于生物膜功能和药物渗透性的研究。论文构建了基于硅纳米孔阵列的支撑人工生物膜系统,利用硅纳米孔阵列的微结构和反射干涉光学现象研究了人工生物膜系统对纳米孔的封闭效应。在所构建的光学传感平台上研究了离子通道蛋白对氢离子的选择性通透功能,同时研究了肽类物质的跨膜行为,以及药物分子跨越内皮细胞的能力。上述研究工作为非标记光学传感器应用于药物筛选奠定了基础。本论文的主要内容如下：(1) 构建了一种硅纳米孔阵列-水凝胶复合材料支撑型人工细胞膜系统,在H+敏感水凝胶的信号放大作用下,研究了复合材料在微环境下对H+的高灵敏传感能力,采用微流控技术成功构建了纳米孔阵列支撑的磷脂双分子层(Phospholipid bilayers, PLBs),傅里叶变换反射干涉光谱(Fourier transferred-reflectometric interference spectrum, FT-RIS)结果表明PLBs能有效阻断溶液中的H+向纳米孔阵列的扩散。在PLBs中镶嵌离子通道蛋白(短杆菌肽A)后,该人工细胞膜恢复了部分离子通透功能。在此基础上研究了离子通道抑制剂的抑制作用,建立了离子通道靶向药物筛选的模型。(2) 构建了一种硅纳米孔阵列表面支撑型人工细胞膜系统,基于人工细胞膜对纳米孔阵列表面非跨膜生物分子的封闭作用,建立了多肽跨越细胞膜过程的实时光学检测方法,研究了TP2、Cecropin A、hIAPP、Dermaseptin等多种跨膜肽(Membrane-translocating peptides, MTPs)分子跨越细胞膜的动力学过程,建立了不同类型MTPs的区分模型,结果与真实微生物抗菌结果、真实细胞膜相互作用结果相吻合。最终建立了针对载体型MTPs和抗菌型MTPs的药物筛选模型。(3) 构建了一种硅纳米孔阵列支撑的体外血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)系统,基质胶Matrigel(?)共培养状态下成功实现了人脑微血管内皮细胞hBMECs的体外培养并形成了紧密连接结构。基于BBB对纳米孔阵列表面非渗透型分子的封闭作用,建立了体外BBB的非标记光学检测方法,研究了不同培养时间下体外BBB通透性的改变,用乙酰胆碱、荧光素钠等模型分子验证了所构建的体外模型。用该模型测试了氯霉素、环丙沙星、红霉素等多种抗生素对BBB的渗透能力,建立了脑外伤药物的体外筛选模型。(4) 构建了一种硅纳米孔阵列表面固定微生物层的系统,基于硅纳米孔阵列的封闭效应,建立了微生物的非标记分析方法。将特定抗体(E.Coli抗体)固定于纳米孔阵列表面并捕获E.Coli后,微生物层对纳米孔阵列的分子通透产生阻碍作用。以BSA作为探针分子,通过测量不同封闭状态下BSA对多孔层光学信号的变化,建立了用于微生物层密度定量分析的非标记光学方法,上述方法在抗菌药物筛选中具有潜在的应用价值。(5) 论文的最后一章介绍了作者在美国斯坦福大学医学院交流访问期间所做的研究工作,建立了一种用于疾病诊断的比色阵列传感器。该比色阵列对不同来源的尿液样本能产生特征光学响应,利用成像系统和信息学图像分析方法提取光学响应信号,并利用统计学算法筛选出阵列式传感的最优化组成。在最优化条件下实现了川崎病和普通发烧患者之间的区分,在训练组中灵敏度和特异性分别为0.94和0.91(其ROC AUC值达到0.981),测试组中则达到0.94和0.82 (ROC AUC值为0.873)。利用统计学算法进行文献信息挖掘并探讨了该传感器的作用机理。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
，

本文编号：2438066