组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对肝星状细胞激活相关生物学特征的影响及其分子机制的研究

发布时间：2019-03-31 12:30

【摘要】：目的评估组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)-异羟肟酸,(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活相关生物学行为及分子标记的影响,并探讨相关的分子机制。方法本研究中的各项实验均在具有激活HSCs表型的人HSCs系LX2中进行。1.荧光实时定量PCR(q PCR)和Western Blots(WB)在mRNA和蛋白质表达水平检测SAHA对HSCs的α肌动蛋白(αSMA)和胶原蛋白I型(collagen I)等HSCs激活分子标志表达的影响。2.通过5-ethynyl-20-deoxyuridine(EdU)掺入法和transwell迁移实验检测SAHA对LX2细胞增殖和迁移的影响。3.通过cDNA基因芯片(Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array)检测SAHA作用于HSCs引起的基因表达差异,并利用IPA生物信息学软件(Ingenuity Pathway Analysis,http://www.ingenuity.com/products/ipa)进一步挖掘差异基因的生物学功能和所参与的经典信号通路,全面解析SAHA抑制HSCs激活表型的分子机制。4.基于生物信息学分析结果,本项研究中我们关注了高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)信号通路。应用si RNA瞬时转染技术对HMGB1进行基因沉默,评估其在SAHA抑制HSCs激活表型中的作用及其可能的机制。结果1.q PCR结果显示,与未处理组相比,SAHA处理组LX2的αSMA和collagen I的mRNA表达分别下降68.02%(p=0.018)和57.96%(P=0.008)。wb结果显示,αsma和cllageni的蛋白水平分别下降了90.80%(p=0.014),和87.30%(p=0.029)。2.edu和transwell结果显示,saha处理组lx2细胞的增殖和迁移能力分别比control组下降了76.25%(p=0.021)和77.89%(p=0.003);。3.人类全转录组基因芯片结果显示,saha处理组lx2细胞中504个基因的mrna表达水平呈现两倍以上的变化,其中与hscs激活密切相关的核转录因子κb(nfκb1)的mrna表达下降2.68倍。通过ipa软件分析上调和下调基因的主要生物学功能和变化显著的信号通路,上调基因参与的生物学功能有:细胞运动,细胞发育,细胞组装和组织,细胞功能和维持,细胞生长和增殖,显著上调的信号通路有:粘附上皮连接重构信号通路,维生素d(1,25-二羟维生素d3)受体(vdr)/类视黄醇x受体(rxr)激活信号通路,过氧化物酶体增殖物活化受体信号通路,支持细胞间连接信号通路;下调基因参与的生物学功能有:细胞生长和增殖,细胞死亡和存活,细胞周期,细胞运动,细胞发育;显著下调的信号通路有:hmgb1通路,整合素连接激酶通路,神经酰胺信号通路,tec蛋白络氨酸激酶信号通路,巨噬细胞内一氧化氮产物和活性氧信号通路。其中我们关注到与hscs激活密切相关的hmgb1/nfκb(nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinbcells)信号通路受到saha显著抑制。4.检测saha处理组lx2细胞nfκb的蛋白表达和核转录活性,验证saha对nfκb的抑制作用。wb检测nfκb蛋白表达,结果显示:细胞内总nfκb1(p50)和p65的蛋白水平分别下降55.0%(p=0.02)和67.0%(p=0.01),双荧光素酶报告基因(dlr)系统检测nfκb转录活性,结果显示:saha处理组nfκb相对荧光素酶活性比未处理组下降70.1%(p=0.001)。5.细胞内hmgb1在saha抑制nfκb表达和转录活性中的作用。sirna沉默hmgb1基因后,继续用saha2.5μm/l处理lx2细胞48hr,qpcr结果显示:nfκb1(p50)的mrna水平接近未处理状态,提示hmgb1可能是saha引起p50mrna水平下降的决定性因素;同样条件处理的wb结果显示:sirna沉默hmgb1后,saha引起的p65蛋白的表达抑制并无显著改变(p0.05),而p50蛋白表达为未处理组的73.7%(p=0.001);dlr结果显示:单独saha处理组的nfκb相对荧光强度为未处理组的29%,sirna沉默hmgb1后,saha处理组lx2细胞的nfκb相对荧光强度为的未处理组的53%。sirna沉默hmgb1后,saha处理组lx2细胞的nfκb荧光强度增高为单独saha处理组的1.76倍。上述结果提示:细胞内的hmgb1对saha引起的nfκb表达和转录活性抑制起到部分作用。6.SAHA处理组LX2细胞,基因芯片及q PCR结果均未发现HMGB1的mRNA表达发生变化,进一步WB检测细胞内总体和核内的HMGB1蛋白表达,两者均无明显变化;细胞免疫荧光显示HMGB1蛋白由原本在核周聚集变得分散,但整体荧光强度无显著变化;免疫沉淀提示,SAHA处理组HMGB1蛋白的赖氨酸残基乙酰化程度显著提高。结论SAHA可以抑制HSCs激活标志性分子表达,细胞增殖和迁移等激活相关生物学行为。其作用机制可能为依赖HMGB1亚细胞定位和赖氨酸残基乙酰化修饰导致的SAHA下调p50表达和NFκB转录活性的抑制。
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【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96
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本文编号：2450901