吖啶黄的新靶点发现及其在肿瘤治疗中的应用研究

发布时间：2019-04-01 09:48

【摘要】：目的：吖啶黄作为抗菌药物曾在临床上广泛使用,而近年来其抗肿瘤活性多见诸于报道,被认为是一类具有前景的潜在抗肿瘤药物。然而针对吖啶黄抗肿瘤作用机制的研究并不多见,更缺乏分子靶点的确证,这极大地限制了吖啶黄在抗肿瘤领域中的进一步应用。本部分研究将以吖啶黄作为研究对象,通过构建基于探针的pull-down系统,探讨吖啶黄直接结合的蛋白以及潜在的作用靶点；在此基础上,设计以吖啶黄为主的联合用药方案,考察合用方案的体内外抗肿瘤作用,并深入阐述其分子机制及影响因素。课题旨在发现吖啶黄全新的作用靶点,指导其在肿瘤治疗领域的临床应用,为肿瘤治疗提供可行的联合用药策略；也为开发具有类似结构的新型抗肿瘤药物提供科学依据与思路。方法：(1) Pull-down实验与HPLC-MS/MS检测分析琼脂糖珠所结合的蛋白；(2)Western blotting考察药物或其他刺激因素作用后细胞内蛋白水平变化；(3)CCK-8及SRB染色法评价药物作用下的肿瘤细胞增殖能力；(4)PI单染、Annexin V-PE/7-AAD染色结合流式细胞术以及DAPI染色法考察细胞凋亡；(5)中性彗星实验、抗53BP1免疫荧光实验检测细胞DSBs损伤及修复情况；(6)建立人源性荷Hela宫颈癌裸小鼠模型和荷HCT116结肠癌裸小鼠模型,检测药物的体内协同抗肿瘤作用；(7)TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡情况；(8)运用siRNA技术沉默p21基因表达；(9)基因表达谱芯片分析相关差异基因的表达。结果：(1)吖啶黄的靶点发现及对DNA-PK的抑制作用研究：构建并验证了连接有吖啶黄的NHS活化琼脂糖珠(ACF-NHS)用于分离吖啶黄结合蛋白(acriflavine-bound proteins)的实验体系,经HPLC-MS/MS分析,综合考虑吖啶黄在细胞内的核浆分布,确定包括DNA-PKcs在内的若干核蛋白为吖啶黄靶点蛋白；计算机模拟分子对接、体外酶活性及细胞水平上的放射线/热刺激造模实验证实吖啶黄能够直接结合于DNA-PKcs的激酶区域,进而抑制其激酶活性。(2)吖啶黄与美法仑协同抗肿瘤作用的研究：烷化剂美法仑能够引起DNA-PKcs活性增加,抑制DNA-PKcs活性能够增强美法仑作用；吖啶黄与美法仑联合用药能显著增加后者抑制细胞增殖的作用,增加caspase依赖的细胞凋亡,相比于同时给药,吖啶黄与美法仑的序贯给药具有更强的协同效果；机制上,吖啶黄能够逆转美法仑单用所引起的DNA-PKcs激活,从而抑制NHEJ修复,明显累积DNA双链断裂(DSBs),进而引起细胞凋亡；这一作用与吖啶黄其他潜在靶点无关；在荷Hela宫颈癌裸鼠模型以及荷HCT116结肠癌裸鼠模型中吖啶黄与美法仑表现出良好的体内协同抗肿瘤作用。(3)p53影响吖啶黄协同美法仑抗肿瘤作用的研究：GSEA分析显示,吖啶黄与美法仑合用显著影响p53信号通路；体内外实验证实p53功能或表达缺失将干扰两药协同抗肿瘤作用；吖啶黄与美法仑联合用药后会上调p53下游凋亡相关基因的转录,同时促进调控细胞周期的p21基因转录及蛋白表达,p21通过抑制CDK2磷酸化进而逆转美法仑单用所诱导的S期阻滞；敲除p21可使吖啶黄与美法仑协同抗肿瘤作用减弱。结论：吖啶黄是一类具有良好临床应用前景的DNA-PK激酶抑制剂,体外抑制活性优于现有DNA-PK抑制剂NU7026。吖啶黄能够抑制DNA-PK介导的NHEJ修复,从而增强美法仑诱导的DSBs及细胞凋亡；其合用效果的增加依赖于p53的表达及功能完整性。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

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