牛、羊乳酪蛋白源DPP-Ⅳ抑制肽的制备、鉴定及抑制机理研究

发布时间：2019-06-20 22:05

【摘要】：糖尿病(DM)是全球范围内增长速度最快和发病率最为广泛的疾病之一,近年来,以肠促胰岛素为作用靶点的抗糖尿病药物—二肽基肽酶Ⅳ (DPP-Ⅳ)抑制剂的研究备受关注。从食物蛋白中寻找天然、无副作用且功能多样的DPP-Ⅳ抑制活性多肽类物质,是解决DPP-Ⅳ抑制药物副作用的一个重要突破口。本文以牛和羊乳酪蛋白(CN)为研究对象,首先采用生物信息学方法预测了两种不同来源酪蛋白中潜在DPP-Ⅳ抑制序列及生物活性潜能,再采用生物酶水解技术制备乳酪蛋白多肽验证两物种间真实的DPP-Ⅳ抑制活性及组成特性差异,然后将蛋白水解物经超滤、二维硅胶薄层色谱或反相高效液相色谱、液质联用等手段分离并鉴定出其所含有效活性肽序列；在此基础上,应用酶动力学、分子模拟等技术手段阐述了DPP-Ⅳ抑制多肽的抑制特性及抑制机理,并探讨了乳酪蛋白DPP-Ⅳ抑制肽对胃肠消化吸收的耐受性及对胰岛细胞的功能。主要研究内容和结果如下：(1)采用生物信息学方法预测比较了牛、羊乳两种不同来源酪蛋白中潜在的DPP-Ⅳ抑制序列及其生物活性潜能。牛、羊乳四种酪蛋白的一级氨基酸序列中均含多个DPP-Ⅳ抑制片段,羊乳酪蛋白中DPP-Ⅳ抑制肽在各酪蛋白组分中出现的概率PC值为κ-CN β-CN αs1-CN αs2-CN,对应牛乳的PC值为β-CN κ-CN αs1-CN αs2-CN;而对于抑制潜能PI值,羊乳酪蛋白的PI值为κ-CN β-CN αs1-CN αs2-CN,对应牛乳PI值为k-CN αs1-CNβ-CN βαs2-CN。总酪蛋白DPP-IV抑制潜能PIΦ综合考虑了四种酪蛋白在牛、羊乳中组成比例及各自PI值的差异,无论来自于高(PIΦ,8.04 10-6 μM-1g-1)还是低(PIΦ,8.25 10-6μM-1g-1) αs1-CN基因品种的羊乳PIΦ都比牛乳(PIΦ,7.7310-6 μM-1g-1)具有微弱的DPP-Ⅳ抑制潜能优势。另外,通过胰蛋白酶模拟水解羊乳酪蛋白,从其释放的肽片段中筛选出两条具有良好DPP-Ⅳ抑制活性的序列GPFPILV和HPINHR,IC50分别达163.7和452.2μM。(2)应用5种商业蛋白酶分别水解牛、羊乳酪蛋白制备活性多肽,比较研究各种蛋白酶酶解物的体外DPP-Ⅳ抑制活性及组成特性差异。结果表明,牛、羊乳原始酪蛋白均没有DPP-Ⅳ抑制能力,酶解产物却具有显著不同的DPP-Ⅳ抑制活性,DPP-Ⅳ抑制活性和水解度之间没有直接对应关系。羊乳酪蛋白比牛乳具有更好的蛋白酶消化特性,其制备所得大部分酶解物的DPP-Ⅳ抑制活性也优于牛乳。筛选出胰蛋白酶作为水解牛或羊乳酪蛋白制备DPP-Ⅳ抑制多肽的最佳用酶,最佳水解时间为3 h。双酶联合酶解并没有显著提高羊乳酪蛋白水解物的生物活性。羊乳酪蛋白胰蛋白酶水解物比牛乳具有更低的IC50值(羊0.801 mg/mL vs牛0.887 mg/mL),其5kDa比5 kDa超滤组分具有更强DPP-IV抑制活性,虽各组分均表现为竞争/非竞争混合型DPP-IV抑制方式,然而其抑制特点和抑制常数Ki值有显著不同。(3)针对乳酪蛋白水解物的超滤组分,采用硅胶薄层色谱和/或高效液相色谱等技术进一步分离,其中高活性子组分再通过液质联用技术鉴定所含肽序列。首次利用二维薄层色谱(第一维和第二维薄层展开剂分别为氯仿：甲醇：25%氨水(2：2：1)和正丁醇：乙酸：水(4：1：1))或一维薄层色谱(薄层展开剂为氯仿：甲醇：25%氨水(2：2：1))/高效液相色谱联用的方法分离、分析蛋白功能水解物中的活性组分,其具有良好的蛋白水解物适用性,并且和后续质谱鉴定技术能够匹配和衔接。LC-MS/MS质谱鉴定出MHQPPQPL, SPTVMFPPQSVL, INNQFLPYPY和YPVEPF四条高效的乳酪蛋白源DPP-IV抑制新序列,特别是INNQFLPYPY的IC50达40.08μM。(4)对分析和鉴定出的有效DPP- Ⅳ抑制肽的抑制特性及抑制机理做了进一步研究。酶抑制动力学分析表明鉴定出的食源蛋白DPP-Ⅳ抑制肽表现出反竞争抑制、非竞争抑制、竞争抑制、竞争/非竞争混合抑制多种抑制模式;反竞争或非竞争抑制肽具有良好的结构稳定性,可看作为DPP-Ⅳ酶的真正抑制剂,而含有第二位Pro的竞争或竞争/非竞争混合抑制肽则可被不等程度降解。分子模拟数据显示这些肽会主要通过氢键和疏水相互作用方式结合在DPP-Ⅳ酶的不同氨基酸位点上。另外,这些DPP-Ⅳ抑制肽之间共存时对DPP-Ⅳ具有明显的相互影响作用,且与抑制肽浓度相关,并且对猪和人两种不同生物来源DPP-Ⅳ酶具有不一致的敏感性和抑制特性,但整体对猪源DPP-Ⅳ酶的抑制活性值要显著高于人源DPP-Ⅳ。(5)探讨了牛、羊乳酪蛋白DPP-Ⅳ抑制肽对胃肠消化吸收后的耐受和稳定性以及对胰岛细胞的功能。经胃肠模拟消化后,牛、羊乳酪蛋白酶解产物的DPP-Ⅳ抑制活性基本维持稳定；其中所含有效序列MHQPPQPL、HPINHR和YPVEPF不存在消化道酶酶切位点,而INNQFLPYPY和GPFPILV则显示出不稳定的抗消化道酶水解能力。小肠上皮细胞对活性肽INNQFLPYPY、 INNQF和MHQPPQPL有完全不同的摄入能力和吸收速度。另外,牛、羊乳酪蛋白水解物对胰岛β-细胞有明显增殖作用,但在两物种间没有显著差异；然而,牛乳酪蛋白水解物对β-细胞的促胰岛素分泌作用显著强于羊乳对应物。
[Abstract]:Diabetes mellitus (DM) is one of the most rapidly growing and most prevalent diseases in the world. In recent years, the study of the anti-diabetic drug dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitor targeting insulin as a target is of great concern. It is an important breakthrough to solve the side effects of DPP-IV. In this paper, we use the bioinformatics method to predict the potential DPP-鈪，

本文编号：2503544