【摘要】：研究背景 药物研发对医疗进步有十分重要的作用。在过去的几十年里,针对心血管,肿瘤,消化系统,疼痛等疾病的新药研发,为疾病治疗提供了更多选择,提高了人群健康水平,生活质量及平均寿命。药物研发是一个昂贵而且耗时的过程,尽管随着科技的进步及投入的增加,但是仍然有90%的新药不能成功进入临床。近十年来,成功上市的新药呈逐年下降趋势,1996年有53种新药通过FDA认证,但到2010年仅有15种。导致新药研发失败的原因有很多,其中主要原因是后期出现的各种药物毒性反应和药效作用不显著。药物研发过程中会对候选药物的药代动力学,药效学,以及毒理学特征进行确认,但传统研发体系缺乏能够在早期准确高效分析药物代谢作用、毒性反应的体外模型。 大部分药物进入体内后的代谢过程主要由肝细胞完成。肝细胞内含有各种参与体内外物质生物转化的酶类。其中,细胞色素P450酶(Cytochrome P450enzymes, CYPs, P450s)是一类含血色素巯基结构的单氧加酶蛋白超家族,是完成相关底物的去毒/生物活化作用的重要药物代谢酶。其中,CYP3A亚家族在肝脏含有P450s中含量最高,约占30%,是主要的临床药物代谢酶类。目前发现CYP3A亚家族包括CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7及CYP3A43. CYP3A4在肝细胞中含量最高达40%,其他组织如小肠,肾脏,肺脏,脑组织等也有CYP3A4的低水平表达。有趣的是,关于脑组织中的表达,Ghosh C et al.近期研究发现CYP3A4不仅参与了药物代谢,还有保护神经元细胞的作用。CYP3A4参与了50%的临床用药的代谢过程,药物代谢谱非常广泛,包括激素,免疫抑制剂,钙离子通道阻滞剂,咖啡因及抗生素等。其中硝苯地平,咪达唑仑及睾酮是CYP3A4的特异性底物,常被用于CYP3A4活性水平检测。有些药物,如曲格列酮,胺碘酮等,经CYP3A4代谢后能产生肝毒性,从而影响了其在临床的应用。一些环境致癌物质(如黄曲霉素B1)也具有经CYP3A4代谢后的肝细胞毒性作用。另外,CYP3A4与药物相互作用也是密切相关的,大量临床用药已被证明可以诱导或抑制CYP3A4的活性,使与这些药物合用的其他药物的血浆浓度减低或升高,导致合用药物的疗效减弱,或升高甚至产生毒性作用。如特非那定,米贝地尔,阿司咪唑及西伐他丁,由于严重的药物相互作用已经退出了市场。 鉴于CYP3A4在药物代谢过程中的重要作用,药物研发过程需要一个能够再现体内CYP3A4代谢作用的体外模型,用来集中评价CYP3A4对备选药物代谢作用和水平,以及备选药物对CYP3A4活性作用的影响。以肝脏药物代谢功能为主要对象,现今用于药物开发体外模型有：以亚细胞结构微粒体为单位的体外代谢模型和以细胞为单位的体外代谢模型(简称：细胞模型),以及组织器官代谢模型。亚细胞结构模型中,人肝细胞微粒体是现今最常用的体外模型,因为其来源广,价格低廉且使用简单；Supersomes是基因工程昆虫细胞产生的微粒体,含有较高活性的CYP3A4[12];其他体外模型还有含有微粒体成分的人肝细胞S9成分等。这些体外模型不能真实反映体内CYP3A4对药物的代谢情况,也不能用于大致预测体内药物代谢水平的定量性分析,因此应用范围有限。组织器官代谢模型是利用组织块或完整器官进行体外药物代谢测试的模型。这些模型虽然在最大程度上保证了代谢主体的完整性,这无疑有利于最大程度地再现体内代谢过程,但其来源罕有并且组织活性维持困难、成本高,所以大多难以常规开展。细胞是机体内最小的完整功能执行者；细胞模型,较单纯的生化模型、细胞器模型,具有更能体现机体生理活动的结构基础和功能能力；较组织器官代谢模型,在技术应用上具有更大的可行性。以细胞为基本功能单位的分析模型(Cell-based assay, CBA)是现代药物研发技术中受到推崇而日益增多使用的模型工具。因此,研发一个CYP3A4高表达的细胞模型,对药物开发就显得十分重要。 研究目的 本实验以C3A细胞为研究对象,通过转染编码嵌合型hPXR的质粒,以提高其CYP3A4的表达水平及药物代谢能力,从而增强C3A细胞在药物研发的应用潜质。 实验方法 1.根据GenBank数据库收录的hPXR及p53-AD的基因序列,设计特异引物,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术以正常人肝组织的cDNA为模板克隆hPXR及p53-AD的基因序列。 2.根据GenBank数据库收录的CYP3A4的基因序列,设计特异引物,采用PCR技术以正常人肝组织的cDNA为模板克隆CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列的基因序列。 3.通过限制性内切酶位点,将hPXR及p53-AD基因定向克隆到真核表达载体pCI-neo上,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体pCI-hPXR-p53。 4.通过限制性内切酶位点,将hPXR及p53-AD基因定向克隆到真核表达载体pCI-neo上,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体pCI-p53-hPXR。 5.通过限制性内切酶位点,将CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列定向克隆到真核表达载体pGL3-basic上,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体CYP3A4.XREM.luc。 6.将已经构建好的载体pCI-hPXR-p53用Nhe I/BamH I酶切下来,和pcDNA3.1(+)的Nhe I/BamH I酶切产物连接,得到一个中间载体pcDNA3.1-hPXR。在中间载体上获得EcoR I酶切位点。将pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切产物和pCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切产物连接,采用酶切鉴定亚克隆载体pCI-hPXR。 7.将目的质粒(pCI-neo、pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR):报告基因质粒(CYP3A4.XREM.luc):内参质粒(TK)分别按46ng:140ng:14ng瞬时转染HEK293T细胞和C3A细胞。转染24小时后,利福平组加入0.2μl10mM的利福平溶液,对照组加入0.2μl DMSO,药物刺激48小时后,进行双荧光素酶检测。 8.将质粒pCI-neo、pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR分别转染C3A细胞。转染24小时后,利福平组加入2μl10mM的利福平溶液,对照组加入2μl DMSO。药物刺激48小时后,收集细胞进行实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测。 9.嵌合型hPXR质粒转染C3A细胞后,经G418抗生素筛选,得到增殖的阳性单克隆,扩大培养后,利用Q-PCR技术检测各个阳性克隆CYP3A4mRNA的表达情况。根据Q-PCR结果,挑选出CYP3A4mRNA表达最高的单克隆。 10. Western blot检测野生型(WT)C3A细胞及稳定表达嵌合型hPXR的C3A细胞的CYP3A4蛋白表达情况。 11.提取WT C3A细胞及稳定表达嵌合型hPXR的C3A细胞的微粒体,以睾酮为底物,利用高效液相色谱技术(HPLC)检测睾酮代谢物(6β-OH睾酮)的生成率,以评价CYP3A4酶的代谢活性。 12.在6孔板中分别培养WT C3A细胞及稳定表达嵌合型hPXR的C3A细胞,以睾酮为底物,利用HPLC技术检测睾酮代谢物(6β-OH睾酮)的生成率,以评价CYP3A4酶的代谢活性。 实验结果 1.以正常人肝组织的cDNA为模板,用特异性引物克隆得到了p53-AD及hPXR基因片段； 2.通过限制性内切酶,将p53-AD及hPXR基因定向克隆到真核表达载体pCI-neo上,筛选得到有p53-AD及hPXR基因插入的真核表达载体pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR; 3.以正常人肝组织的cDNA为模板,用特异性引物克隆得到了CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列的基因序列； 4.通过限制性内切酶,将CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列定向克隆到真核表达载体pGL3-basic上,筛选得到有CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列插入的真核表达载体CYP3A4.XREM.luc; 5.将已经构建好的载体pCI-hPXR-p53用Nhe I/BamH I酶切下来,和pcDNA3.1(+)的Nhe I/BamH I酶切产物连接,得到一个中间载体pcDNA3.1-hPXR。在中间载体上获得EcoR I酶切位点。将pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切产物和pCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切产物连接,通过酶切鉴定,得到亚克隆载体pCI-hPXR; 6.在转染的HEK293T细胞中,双荧光素酶报告基因检测质粒pCI-neo, pPCI-hPXR, pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR对报告基因质粒CYP3A4.XREM.luc的作用。在R1f(+)组中,转染质粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR后,1uciferase活性高于pCI-hPXR及pCI-neo,且pCI-hPXR-p53对luciferase活性的增强作用比普通型pCI-hPXR高1.5倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高9.5倍,具有统计学差异(p0.05)；在Rif(—)组中亦是如此(p0.05)。 7.在转染的C3A细胞中,双荧光素酶报告基因检测质粒pCI-neo、 pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR对报告基因质粒的作用。在Rif(+)组中,转染质粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR后,对luciferase活性的增强作用高于pCI-hPXR及pCI-neo,且pCI-hPXR-p53对luciferase活性的增强作用比普通型pCI-hPXR高5.4倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高9.1,具有统计学差异(p0.05)；在Rif(—)组中亦是如此(p0.05)。 8.质粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR、pCI-hPXR及pCI-neo瞬时转染C3A细胞后,通过Q-PCR检测CYP3A4mRNA的变化。在Rif(+)组中,质粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR转染后,CYP3A4mRNA的表达高于pCI-hPXR及pCI-neo,具有统计学差异(p0.05)；且pCI-hPXR-p53对CYP3A4mRNA表达的增强作用是普通型pCI-hPXR的2.3倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高1.65倍；在Rif(—)组中亦是如此(p0.05)。 9.嵌合型hPXR质粒转染C3A细胞后,经G418筛选,得到了13个增殖的阳性单克隆,其中包括7个稳定表达pCI-hPXR-p53的细胞系(A1-A7)和6个稳定表达pCI-p53-hPXR的细胞系(B1-B6)。 10. Q-PCR检测13个单克隆的CYP3A4mRNA表达情况发现,A5细胞系中CYP3A4mRNA的表达最高,是WTC3A细胞的2.5倍(p0.05),故挑选它进行下一步研究。 11.Western blot检测CYP3A4蛋白的表达情况发现,CYP3A4蛋白在A5细胞系中的表达比WTC3A细胞提高了1.5倍(p0.05)。 12.WTC3A细胞在微粒体水平及细胞水平均未检测到6β-OH睾酮的生成,而A5细胞系在细胞水平及微粒体水平检测到6β-OH睾酮的生成率分别为55pmol/mg protein/min和714pmol/mg protein/min,可见A5细胞系的药物代谢能力显著提高。 实验结论 成功构建了pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR、pCI-hPXR及CYP3A4.XREM.luc4个真核表达载体,双荧光素酶报告基因检测发现,嵌合hPXR(pCI-hPXR-p53、 pCI-p53-hPXR)对CYP3A4启动子的反式激活作用比pCI-hPXR更强,并Q-PCR结果进一步证实了嵌合型hPXR对CYP3A4的激活转录作用更强。 嵌合型hPXR质粒稳定转染C3A细胞后,得到了CYP3A4mRNA表达最高的A5细胞系。它的CYP3A4蛋白表达和CYP3A4介导的药物代谢能力也得到了相应的提高,这无疑是为药物代谢和毒性研究提供了一个新的体外细胞模型。
文内图片：
图片说明：pCI-p53-hPXR骨架Figure1-2ThebackboneofpCI-p53-hPXR
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R969.1
【共引文献】
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本文编号：
2512431
