Amycolatopsis alba DSM44262中ansacarbamitocins的生物合成研究

发布时间：2019-08-02 15:25

【摘要】：美登素类化合物(maytansinoids)是一类以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为起始单元,由Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)合成的19元大环内酰胺类安莎霉素,具有很好的抗菌和抗肿瘤活性。基于美登素的抗体偶联药物ado trastuzumab entansine(商品名Kadcyla)已经被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌的治疗,此外,尚有10余种偶联该类毒素的抗体偶联药物正处于临床研究阶段。美登素类抗体偶联药物合成的核心前体美登醇(maytansinol)目前是由微生物发酵得到的安丝菌素类(ansamitocins)在体外经半合成制备而成,但该方法存在成本高、产率低、副产物不易分离除去等缺点,不利于美登素类抗体偶联药物的研究和生产。因此,寻找新的美登醇替代来源具有重要意义。前期,本实验室从白色拟无枝酸菌Amycolatopsis alba DSM44262中分离鉴定了 5个美登素衍生物ansacarbamitocins(1-5)。我们通过对DSM44262菌株基因组序列的生物信息学分析,定位了 ansacarbamitocins的合成基因簇abm。通过与已报道的安丝菌素合成基因簇比较,发现abm基因簇含有2个氨甲酰基转移酶基因abm2la和abm2lb,及1个N-糖基转移酶的基因abm25,推测它们可能分别负责ansacarbamitocins C3和C7位羟基的氨甲酰化,及ansacarbamitocins的N-糖基化。因此,有望通过敲除负责C3位羟基氨甲酰化的基因及abm25获得美登醇类似物。为此,我们首先建立了A.alba DSM44262的菌丝体电转化遗传操作体系;然后分别对abm2la和abm2lb和abm25进行了体内敲除。通过对abm2la和abm2lb敲除突变株积累中间产物的分离鉴定,发现2株敲除突变株积累的中间产物相同,即积累了 大量的 19-chloroproansamitocin 和少量的 14-OH-19-chloroproansamitocin,从而推测abm2la和abm2lb可能共同参与ansacarbamitocins中C3和C7位羟基的氨甲酰化。通过对abm25敲除突变株积累中间产物的分离鉴定,获得了N-deglucosyl-ansacarbamitocinA,表明abm2 参与了 ansacarbamitocins 的 N-糖基化。此外,由于抗生素类N-糖基转移酶难以获得可溶性重组蛋白,限制了其体外功能研究,因此,我们开展了 abm25的体外研究。对abm25基因进行了系统的异源表达条件摸索,最终获得了可溶且有活性的His-SUMO-Abm25融合蛋白,这是首次获得的可溶且有活性的N-糖基转移酶。通过测定不同pH值和温度对Abm25酶活的影响,发现Abm25的最适pH为8.0,最适反应温度为37℃。接着,我们进一步测定了 Abm25的动力学参数,在UDP-葡萄糖500 μM的条件下,19-chloroproansamitocin 对应的 为 2.44士0.26 μM,kcat 为 0.24±0.01 min-1;在19-chloroproansamitocin400 μM 的条件下,UDP-Glc 对应的Km为 10.22±1.36 μM,kcat为0.15±0.01 min-1。与此同时,还开展了 Abm25的底物广谱性研究,发现Abm25对于糖受体具有严格的专一性,糖供体除UDP-葡萄糖外还可利用UDP-葡萄糖醛酸,丰富了抗生素类N-糖基转移酶工具酶库。本研究鉴定了白色拟无枝酸菌DSM44262中的ansacarbamitocins合成基因簇,主要对其后修饰过程中的氨甲酰基转移酶基因abm21a与abm21b和N-糖基化酶abm25进行了研究。进一步的工作可以在DSM44262的abm21a/abm21b及abm25敲除突变株基础上回补来源于安丝菌素基因簇的asm21基因(Asm21可催化19-chloroproansamitocin中C7位羟基的氨甲酰化),以期构建美登醇类似物产生菌株,为进一步的美登素类抗体偶联药物研究奠定基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R915

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本文编号：2522200