重组人成纤维细胞生长因子18在昆虫细胞中的表达及其药理活性研究

发布时间：2019-09-07 15:29

【摘要】：成纤维细胞生长因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18),是1998年首次从鼠胚胎中分离出来的一种成纤维细胞生长因子,与FGF17同属于FGF8亚家族。研究表明FGF18在血管生成、形态发生和细胞发育中发挥了重要的作用。此外,它还是发育组织中的一种分泌性信号分子,在软骨和骨骼发育中发挥着重要的作用。但是由于FGF18蛋白稳定性差,产量低,一直影响着FGF18在药物上的研究进展。虽然FGF18也曾在植物细胞、原核细胞中尝试表达,但该蛋白的稳定性和产量一直没有得到解决。因此,本论文提出了一种新的、快速、有效的表达纯化策略。本文使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(IC-BEVS),让FGF18在昆虫细胞中进行表达,并对昆虫表达系统的特性和FGF18蛋白的性质进行研究。双酶切含有优化后的hFGF18基因的载体,将目的基因连接到pFastBac杆状病毒转移载体上,获得的p FastBac-hFGF18质粒,转化到含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,利用细菌转座子原理,在大肠杆菌内完成Bacmid-rhFGF18重组,通过蓝白斑筛选,挑选出阳性重组质粒。通过脂质体转染法,将重组质粒转染到Sf9昆虫细胞内,再经过重复侵染获得高滴度病毒。因为昆虫细胞-杆状病毒表达系统中蛋白的收获时间和表达条件影响着重组蛋白的产量和质量。因此,为了提高蛋白产量,我们对rhFGF18蛋白的表达条件进行了优化。首先在确定感染复数(MOI)条件下,侵染对数生长期的昆虫细胞,收获侵染24,36,48,60,72,84,96,108,120h后的蛋白样品,采用Western Blot法进行鉴定得到最佳感染时间(TOI);再取五瓶生长状态相同的昆虫细胞,用不同的MOI侵染细胞,收获的样品用Western Blot进行鉴定找到最佳的MOI。在最佳的表达条件下,对样品扩大培养。利用FGF18的等电点和肝素亲和特性,我们采用肝素亲和柱和SP-FF阳离子交换柱对蛋白样品进行纯化,并通过Western Blot确认纯化后的rhFGF18蛋白。最后,对纯化后的rhFGF18蛋白体外活性进行研究,运用MTT的方法检测rhFGF18蛋白对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的促增殖效果;采用碱性磷酸酶染色法和竞争法测定MC3T3-E1培养上清中碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)的含量。昆虫偏好密码子优化的hFGF18,通过转座子原理,成功地构建了重组载体BacmidrhFGF18,并且分子量约为22 kDa的rhFGF18在昆虫细胞中得到了表达。病毒侵染Sf9细胞72h后蛋白表达量达到最高,当MOI为3时,重组蛋白的表达量最好。在蛋白纯化过程中,用含不同盐离子浓度的缓冲液对肝素亲和柱进行梯度洗脱,目的蛋白被含有1.0M NaCl的25mM Tris洗脱下来。超滤除盐后,rhFGF18被含有0.8M NaCl的25mM Tris从阳离子柱中洗脱下来。BCA蛋白浓度测定所得的纯化蛋白浓度约为80mg/L。体外活性实验测定结果表明,rhFGF18对MC3T3-E1具有明显的促增值作用,给药7天后,和对照组相比,rhFGF18均能提高细胞内碱性磷酸酶和骨钙素的含量,初步探讨了rhFGF18作为骨质疏松药物的可能性。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2533106