TRPV4在TGF-β1诱导HSC增殖中的作用及miR-203的调控研究

发布时间：2019-09-10 21:38

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝脏对各种病因所致的慢性损伤产生的修复反应,以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝内大量沉积为其主要特征。肝纤维化持续发展最终可形成肝硬化甚至转化成原发性肝细胞癌,已成为危害人类健康的世界性问题。然而对于肝纤维化迄今仍没有发现满意的治疗药物和方法,阐明肝纤维化形成中相关的分子机制,对减少肝硬化及原发性肝细胞癌的发生具有重要的意义。肝脏受损时,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖在肝纤维化形成过程中起主导性作用。积极寻找导致HSC活化增殖等病理生理过程的关键环节是防治该病的重点之一。有研究表明,HSC中离子浓度的改变可影响HSC的活化增殖,因此HSC细胞膜上的离子通道成为调控HSC增殖与凋亡的新靶点。阳离子通道TRPV4是瞬时受体电位通道TRP家族(TRP channels)中的成员之一,广泛分布于中枢和外周神经系统、肝脏、肾脏、心脏等多种组织,参与听觉、触觉、痛觉传导,及细胞的增殖、迁移、凋亡等多种病理生理过程。课题组前期研究发现,TRP家族成员TRPM7具有抑制HSC增殖并促进其凋亡的作用。本实验重点研究TRPV4在HSC活化增殖中的作用,及其调控机制,为肝纤维化防治提供新的靶点。主要研究内容概括如下： 1.TRPV4在体与离体表达变化以人体肝血管瘤组织为正常肝组织,肝炎后肝硬化脾亢患者及肝癌患者癌旁2cm以外,为肝纤维化组织(经病理学组织染色确认)。采用免疫组化、RT-PCT、 Western blot等方法检钡TRPV4的基因与蛋白的表达变化。结果发现：与正常肝组织相比,人体肝纤维化组织中TRPV4基因与蛋白的表达明显增高。每周2次皮下注射含50%CCl4的植物油溶液(1ml/kg),建立大鼠肝纤维化模型(共12周)；动物实验结果证实,与正常肝组织相比,大鼠肝纤维化组织中TRPV4mRNA及蛋白表达水平均明显增高。体外实验部分以大鼠肝星状细胞株HSC-T6为研究对象,使用TGF-β1(10ng/ml)处理细胞(24h),qRT-PCR、Western blot结果表明,与未诱导组比较,TGF-β1明显诱导HSC-T6中TRPV4mRNA与蛋白水平。提示TRPV4可能参与调控HSC的活化增殖,影响肝纤维化的进程。 2. TRPV4对HSC-T6增殖的影响及部分机制研究 TRPV4特异性阻断剂luM钌红(Ru)预处理HSC-T6细胞,加入TGF-β1诱导24h后,MTT检测结果表明,与正常HSC-T6细胞比较,钌红预处理组HSC-T6细胞的增殖明显受到抑制；qRT-PCR、Western blot检测显示,HSC活化标志物a-SMA的]mRNA与蛋白明显降低。利用LipofectamineTM2000介导的siRNA技术特异性沉默HSC-T6内TRPV4,结果表明特异性阻断TRPV4,可明显抑制HSC-T6增殖与a-SMA mRNA与蛋白的表达水平。进一步研究发现,转染TRPV4-siRNA,可明显抑制AKT的磷酸化水平。提示TRPV4可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HSC的活化增殖。 3. TRPV4上游调控机制研究课题组前期研究证实,表观遗传修饰在肝纤维化形成过程中具有重要作用,miRbase, miRANDA, and Targetscan5.1软件预测均显示,TRPV4是miR-203的作用靶标。为探讨调控TRPV4的调控机制,我们研究了miR-203在肝纤维化组织与HSC的表达变化,及其对TRPV4的调控作用。结果发现,在体肝纤维化组织与离体TGF-β1诱导的HSC-T6中,miR-203表达均明显降低。LipofectamineTM2000转染miR-203的模拟物mimics到HSC-T6细胞内,可明显降低HSC-T6的增殖、α-SMA mRNA与蛋白的表达；并可抑制TRPV4的表达；而应用TRPV4的激动剂,则明显降低,miR-203的模拟物mimics对HSC-T6增殖的抑制率。荧光素酶实验结果进一步证实miR-203靶向TRPV4。提示miR-203具有调控HSC-T6活化增殖的作用,其功能与其靶向TRPV4有关。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】