PI3K抑制剂BKM120对乳腺癌多药耐药细胞抑制作用及其机制研究

发布时间：2019-09-16 00:10

【摘要】：目的:1.对比研究单用PI3K抑制剂BKM120对乳腺癌化疗药物敏感细胞系和耐药细胞系间的差异作用,了解BKM120对乳腺癌化疗耐药细胞体内、体外的抑制作用,并进一步探讨其对耐药细胞发挥抗癌作用的作用机制。2.在体内、体外实验中联合应用PI3K抑制剂BKM120及化疗药物阿霉素,以研究BKM120联合常规化学治疗药物对乳腺癌化疗耐药细胞体内、体外的抑制作用及其潜在的机制。方法:1.利用MTT方法,比较BKM120和常见化疗药物对乳腺癌化疗药物敏感细胞系和耐药细胞系间的差异作用,并通过Annexin V/P染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测BKM120对目标细胞的凋亡诱导作用,同时使用实时定量PCR法检测凋亡相关基因的mRNA水平改变;在机制研究中,采用Western-blotting检测了PI3K/AKT/NF-κB信号转导通路活性的改变,免疫荧光实验明确了NF-κB p65亚基在BKM120作用后的总体表达量及定位的改变情况。分别以ALDH及CD44+/CD24-为乳腺癌干细胞标志物,利用流式细胞仪检测乳腺癌敏感细胞系及耐药细胞系中干细胞比例,同时对比BKM120单药治疗前后干细胞比例的改变。同时利用球囊培养技术及软琼脂克隆形成技术检测BKM120对不同细胞系的干细胞体外成瘤能力的影响。构建乳腺癌耐药细胞株的体外移植瘤小鼠模型,将小鼠随机分为对照组、BKM120组,检测BKM120单药对于乳腺癌耐药细胞系的体内抑制作用。2.采用MTT方法检测BKM120与阿霉素两药联合对于乳腺癌敏感细胞系级耐药细胞系中的作用,通过CalcuSyn软件,进行ChouTalalay法检测联合指数(combination index,CI)以明确BKM120与阿霉素两药之间的联合作用方式。构建乳腺癌耐药细胞株的体外移植瘤小鼠模型,将小鼠随机分为BKM120单药组、阿霉素单药组以及两药联合组,检测BKM120与阿霉素联合应用对乳腺癌耐药细胞系的体内移植瘤的抑制作用。结果:1.在以乳腺癌MDR细胞系MCF-7/A02和CalDOX,以及其对应敏感细胞系MCF-7和Cal51为研究对象的MTT实验中,发现BKM120对于敏感细胞系及耐药细胞系均存在抑制作用,且呈浓度依赖性,二者之间ic50仅存在1.2-6.8倍的差异,远小于常规化疗药物敏感和耐药细胞系ic50间的差异。克隆形成实验检测bkm120对上述细胞系的长期抑制作用发现:bkm120可长期抑制耐药细胞系的生长能力。2.分别通过annexinv/propidium染色法,caspase-3/7活性检测以及caspase-9检测法等3种方法检测bkm120对敏感细胞系及耐药细胞系的凋亡诱导作用,发现bkm120对耐药细胞系仍存在诱导凋亡的作用。在发生凋亡的机制研究中发现bkm120作用于耐药细胞系后,mrna水平上,survivin的mrna转录水平显著下调,而bim和bax显著上调,在蛋白水平,bkm120可有效抑制pi3k/akt通路活性,且nf-κbp64亚基在总蛋白和核蛋白的表达均有所降低。3.在bkm120单药对耐药细胞中干细胞亚群的作用分析发现,耐药细胞系中cd44+/cd24-细胞和aldh+细胞的比例均显著增加。当bkm120分别作用于mcf-7/a02和caldox细胞时,cd44+/cd24-细胞和aldh+细胞的比例均有所下降,且呈浓度依赖性。进一步研究bkm120对干细胞体外成瘤能力影响发现,bkm120作用后,耐药细胞系mcf-7/a02和caldox的球囊形成能力及克隆形成能力均显著下降。4.分别构建mcf-7/a02和caldox细胞体外移植瘤裸鼠模型,可见与体外细胞学实验结果一致,裸鼠在可耐受bkm120单药治疗的同时,bkm120可有效抑制移植瘤的增长,且可降低移植瘤中pakt蛋白及细胞核内nf-κbp64亚基的表达。5.bkm120联合阿霉素分别作用于敏感细胞系和对应的耐药细胞系的研究中可见,bkm120与阿霉素在耐药细胞系中的协同作用更为显著,而在敏感细胞系中两药联合的协同作用较弱。在体外移植瘤模型中的结果与体外研究结果一致:两药联合对体内移植瘤的抑制作用得到了显著增加。结论:1.在体内体外实验中,pi3k抑制剂bkm120可有效抑制乳腺癌耐药细胞系的生长增殖及成瘤能力,其发挥作用的机制可能存在以下2种:bkm120可通过抑制pi3k/akt/nf-κb信号通路活性,抑制nf-κb入核,从而诱导细胞发生凋亡;bkm120可有效抑制耐药细胞系中乳腺癌干细胞的比例,从而发挥对耐药细胞生长增殖及成瘤能力的抑制作用。2.在针对耐药细胞的体内体外实验结果均证实PI3K抑制剂BKM120与常规化疗药物阿霉素两药间存在协同作用。
【图文】：

图 1.1 BKM120 对乳腺癌敏感细胞与耐药细胞的生长抑制作用为了进一步研究 BKM120 对敏感及耐药细胞系的长期作用，我们利用平板克隆形成实验进行了检测。与预想中得结果一样，相同药物浓度下，阿霉素对耐药细胞系生长的抑制作用较敏感细胞系显著降低。在作用 1 周后，BKM120显著降低了耐药细胞的生长能力(图1.2)。可见，对于对传统化疗药物耐药的MDR细胞系而言，BKM120 可有效抑制其生长。

图 1.1 BKM120 对乳腺癌敏感细胞与耐药细胞的生长抑制作用为了进一步研究 BKM120 对敏感及耐药细胞系的长期作用，我们利用平板克隆形成实验进行了检测。与预想中得结果一样，，相同药物浓度下，阿霉素对耐药细胞系生长的抑制作用较敏感细胞系显著降低。在作用 1 周后，BKM120显著降低了耐药细胞的生长能力(图1.2)。可见，对于对传统化疗药物耐药的MDR细胞系而言，BKM120 可有效抑制其生长。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2536009