毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用

发布时间：2019-09-18 12:03

【摘要】：毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、灵敏度高以及易于实现自动化等诸多特点,在筛选酶抑制剂研究中有着不可替代的优势。本文综述了毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用。主要介绍了应用最广泛的离线分析(Off-line assay)和在线分析(In-line assay),即柱前酶反应(Pre-capillary enzyme reaction)和在柱酶分析(In-capillary enzyme reaction)。并对该领域的未来发展进行了展望。
【图文】：

区带,模式,在线分离,连续模式

图1在线分离的模式，(A)EMMA连续模式;(B)经典区带-区带模式;(C)部分填充模式;(D)快速切换电极EMMA;(E)进样端轴向扩散模;(F)层流剖面的横向扩散［31］Fig．1Modesofon-lineenzymeassay，(A)Continuousengagementelectrophoreticallymediatedmicroanalysis(EMMA);(B)Classicplug-plugmode;(C)Partialfillingtechnique;(D)RapidpolarityswitchingEMMA;(E)At-inletlongitudinaldiffusion;(F)Transversediffusionoflaminarflowprofiles(TDLFP)［31］双磷酸水解酶抑制剂，为了防止酶吸附在毛细管内壁引起峰展宽，用聚丙烯酰胺修饰毛细管内壁，修饰之后毛细管内壁由原来的负电荷变为正电荷，因此电渗流反向流向正极，则转换电压极性来保证电渗流流向检测器一端。反应物以“底物-酶-底物”的三明治模型在毛细管进样端进样。由于产物电迁移方向和电渗流方向相同，从而缩短了迁移时间。在血管紧张素转换酶的酶活动力学研究中，vanDyck等［8］分别使用长端和短端进样口技术进行实验，比较两者发现，由于短端进样技术中毛细管有效分离长度小，分析时间明显缩短。Wang等［34］使用轴向扩散技术从天然产物中筛选出蛋白激酶抑制剂，并使用LC-MS/MS来鉴定抑制剂的种类。在毛细管进样端进样反应物，通过自由扩散实现混合而引发反应，反应较短时间后施加电压分离产物和反应物。Nehmé等［35］使用轴向扩散技术研究β-半乳糖苷酶的酶促反应动力学和抑制动力学，反应物的注射顺序为:孵育缓冲液、底物、酶、抑制剂、孵育缓冲液，反应物通过自由扩散实现混合，引发酶促反应，实验中不需要预先将待测酶抑制剂与底物混合，不仅减小了工作量，而且可以减少底物的使用量。3．2．2固定化酶微反应器(IMER)上述的酶抑制剂筛选方法中，酶不能重复利用，，浪费试剂。而固定之?

固定化方法,微反应器,交联法,固定化酶

毛细管整体柱的多孔聚合物表面，然后将酶固定在纳米金颗粒上。共价键合法和交联法，虽然固定化酶稳定性好，但不可再生和回收利用，而且可能会降低酶活性。申刚义等［45］以氨基硅烷化试剂为介导，在毛细管内壁修饰上氨基，然后采用共价键合法将表皮生长因子受体固定在毛细管内壁，结合毛细管电泳，利用表皮生长因子受体微反应器在线测定了抑制剂吉非替尼对表皮生长因子受体的抑制性能。Min等［46］利用双功能试剂戊二醛制备了胰蛋白酶微反应器，并且成功地从19种天然产物提取物中筛选出了胰蛋白酶抑制剂。大体步骤如下(图2):首先通过氨丙基三甲氧基硅烷(3-APTES)与毛细管内壁的硅羟基结合，然后3-APTES的氨基和戊二醛的醛基作用，结合上戊二醛之后，戊二醛的另一个醛基与酶的氨基结合，酶被固定，毛细管的剩余部分作为分离通道。Wang等［47］使用硅烷化试剂和戊二醛交联酶，制备了葡萄糖氧化酶(GOx)固定化酶微反应器，以Ag+和Cu2+作为标准抑制剂在固定化反应器中研究了其对GOx的抑制作用。Zhao等［48］利用双功能团试剂戊二醛交联技术在毛细管出口端制备了固定化神经氨酸苷酶微反应器用以筛选其抑制剂，固定之后的酶稳定性增加，而且短端进样大大提高了筛选效率。图2交联法固定化酶微反应器［46］Fig．2Immobilizedenzymemicroreactorbycross-linking［46］除上述固定化方法之外，也有新的固定化方法在不断发展完善。Liu等［49］使用颗粒填充技术制备了毛细管固定化酶微反应器:利用粒径为毛细管直径的两个硅胶粒子作为结块，将固定酶的大孔珠固定在结块之间，从而制备了固定化酶微反应器。大孔珠可以保证溶液通过，以减小背压，制备过程简便快速，而且通过调节填充的大孔珠的量，可以调节酶的固定量和固定化微反应器的长度?
【作者单位】：中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室;中国科学院大学;
【基金】：国家自然科学基金(Nos.21105106,21375136)资助~~
【分类号】：R917;O658.9

【参考文献】