大孢粘球菌抗肿瘤活性蛋白WGF5分离方法的优化与活性分析

发布时间：2019-09-20 14:43

【摘要】：为从Myxococcus macrosporus STXZ54发酵液中高效地分离纯化出抗肿瘤活性蛋白WGF5,收集STXZ54发酵上清液,先后利用优化后的硫酸铵沉淀方法沉淀蛋白,强阳离子交换、分子筛色谱分离等方法对蛋白粗提物进行精细分离.利用CCK-8试剂盒,倒置显微镜、扫描电子显微镜等观察WGF5对肿瘤细胞形态的影响,台盼蓝染色进一步检测WGF5对肿瘤细胞的毒力.实验结果观察到WGF5能够显著改变肿瘤细胞形态,与原分离体系相比较,优化后的抗肿瘤活性蛋白分离方法更为高效,简便易行.
【图文】：

色谱,抗肿瘤活性,硫酸铵沉淀,蛋白

7721的毒力将在六孔板接种的细胞置于细胞培养箱培养12h，实验组加入10mg/LWGF5，而对照组加入相同体积的PBS，实验组和对照组都做相同时间梯度:0，24，36，48，60h．收集细胞PBS洗涤2次后，80μL无菌去离子水重悬细胞，然后加入80μL台盼蓝染色液常温染色5min，细胞用血球计数板进行计数，计算细胞的死亡率．2结果与分析2．1硫酸铵分级沉淀抗肿瘤活性蛋白利用硫酸铵分级沉淀梯度分别为0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分级沉淀出的4组蛋白，作用B16肿瘤细胞24h，CCK-8试剂盒测定各组样品的肿瘤细胞抑制率．实验结果如图1-a所示，各饱和度下沉淀的蛋白均对两种肿瘤细胞具有细胞毒性，且35%～70%饱和度区沉淀出蛋白的细胞毒性为83%，显著高于其他三组蛋白的抗肿瘤活性．硫酸铵分级沉淀浓度为40%～75%时(原方法所使用的硫酸铵分级沉淀浓度梯度)，其沉淀出的蛋白细胞毒性在73%左右．SDS-PAGE检测硫酸铵分级沉淀梯度分别为35%～70%(图1-b，泳道1)、40%～75%(图1-b，泳道2)沉淀出的两组样品的蛋白条带发现，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸铵分级沉淀出的蛋白中WGF5含量较高．因此，考虑选用35%～70%硫酸铵梯度沉淀法沉淀抗肿瘤活性蛋白．2．2强阳离子交换色谱分离抗肿瘤活性蛋白将提取的抗肿瘤活性粗提蛋白用强阳离子交换色谱进行分离，分离结果如图2-a所示，图中出现两个色谱峰，穿透峰(峰A)在色谱程序开始后不久就被洗脱下来，峰面积较大，最高点接近3500mAU．紧随峰A被洗脱下来的色谱峰(峰B)，保留时间为6．5min．收集各峰进行细胞毒性实验，并对A和B两活性峰进行SDS-PAGE检测，结果表明WGF5在峰B中．大量收集活性峰B，进行下一步分离纯化．图1硫酸铵沉淀分离抗肿瘤活性蛋白Fig．1Separationofantitumoractiveproteinsbyammoniumsulfateprec

抗肿瘤活性,蛋白

魏慧等:大孢粘球菌抗肿瘤活性蛋白WGF5分离方法的优化与活性分析图3分子筛色谱分离抗肿瘤活性蛋白Fig．3Separationofantitumoractiveproteinsbymolecularsievechromatography图4SDS-PAGE检测活性蛋白纯度Fig．4DetactionofproteinsbySDS-PAGE2．5台盼蓝染色观察WGF5对B16细胞的毒性作用用4%台盼蓝染色液对WGF5作用不同时间的B16细胞进行染色．早期凋亡的细胞及未死亡的细胞中细胞膜结构较完整，不易被台盼蓝染液染成蓝色，从而可以通过这种染色手段将活细胞与死细胞区分开来．从图5可以看出，随作用细胞的时间增大，被染色的死细胞数目比例逐渐增加．在WGF5作用48h后，细胞死亡比例达到了67%，而之前CCK-8试剂盒测得细胞死亡率在67%之上，，可以分析得出在CS3作用细胞期间，细胞可能发生了早期凋亡．2．6扫描电子显微镜观察细胞形态变化扫描电子显微镜观察WGF5对B16细胞形态的影响，结果如图6所示，在对照组中，B16细胞具有明显的细胞形态变化，细胞形态正常．实验组中B16细胞的细胞伪足消失，细胞结构坍塌瓦解，细胞变圆死亡，足见WGF5对人脐带静脉内皮细胞没有明显的毒力．图5WGF5对肿瘤细胞存活率的统计分析Fig．5StatisticalanalysisoftheB16cellssurvivalratewhentreatedwithWGF5图6扫描电镜观察B16细胞的形态变化(8000×)Fig．6B16cellswereanalyzedwithscanningelectronmicroscopy(8000×)3讨论粘细菌是最高级的微生物类群，科研工作者从中挖掘抗肿瘤新药物的研究体系也日趋完善［14］．就目前研究现状来看，粘细菌抗肿瘤新药物的开发潜力远大于放线菌［15］．2014年Jansen等从粘细菌Nannocystispu-sillaNaa174菌株中分离得到的pyrronazolsC1和C2两种活性物质对多种肿瘤细胞系均有抑制作用，其中对人卵巢癌细胞SK-OV-3的活性?
【作者单位】：湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室淡水鱼类发育生物学国家重点实验室;
【基金】：国家“973”基础研究计划资助项目(2012CB722301) 湖南省“生物发育工程及新产品研发协同创新中心”资助项目(20134486)
【分类号】：R915

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