两栖类抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽对新生血管生成和黑色素瘤转移侵袭影响的研究

发布时间：2019-09-23 21:41

【摘要】：黑色素瘤(melanoma)是一种高度恶化并具有快速转移和高度侵袭特性的肿瘤,该瘤进展迅速,预后极差,并对一般的化疗药物具有耐受性,因此缺乏有效的治疗药物。近年来,具有抗癌活性的阳离子抗菌肽由于其独特的作用机制,逐渐受到人们的广泛关注。我们前期的研究工作发现,来自于中国林蛙皮肤分泌物的阳离子抗菌肽Temporin-1CEa具有较好的选择性抗癌活性。在本论文中,我们将对Temporin-1CEa及其六个改造肽的黑色素瘤选择性杀伤作用进行考察,并进一步对其抗肿瘤血管新生和抑制肿瘤转移和侵袭的活性进行了初步的评价。我们首先利用MTT法考察了Temporin-1CEa及其改造肽对人黑色素瘤A375细胞和人永生化表皮Hacat细胞的细胞毒作用。实验结果表明,Temporin-1CEa及其改造肽对A375细胞具有不同程度的杀伤作用,其作用强度依次为LK2(6)AN(2L)LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1LK3LK2(6)LK2(5),其中Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)对肿瘤细胞具有较好的选择性。此外,通过Annexin V-FITC单染,采用流式细胞仪对A375细胞和Hacat细胞表面的负电荷成分磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)含量进行了检测,结果显示A375细胞表面PS含量明显高于Hacat细胞,这可能是Temporin-1CEa及其改造肽选择性杀伤A375细胞的机制之一。同时,我们的实验结果还发现,加入NaClO3抑制细胞表面硫酸基团的表达后,能够明显增强Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)的抗肿瘤活性,显示细胞表面硫酸基团能够减弱抗菌肽与肿瘤细胞之间的相互作用。在明确了Temporin-1CEa及其改造肽对人黑色素瘤A375细胞的选择性杀伤作用之后,我们又进一步对其抗黑色素瘤转移和侵袭的活性进行了考察。Transwell迁移/侵袭实验结果显示,Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)对A375细胞的迁移/侵袭具有明显的抑制作用,其作用强弱顺序为Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。此外,采用ELISA方法检测人基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和人血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达,实验结果显示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能够抑制A375细胞MMP-2和VEGF的释放,且抑制效果呈剂量依赖方式,提示Temporin-1CEa及其改造肽的肿瘤转移和侵袭抑制活性可能与降低黑色素瘤细胞MMP-2和VEGF的表达和释放有关。由于肿瘤的迁移和侵袭与血管新生密切相关,因此,我们对Temporin-1CEa及其改造肽的抗血管生成活性进行了初步的评价。人脐静脉血管内皮HUVEC细胞的细胞毒实验结果表明,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能够抑制HUVEC细胞的增殖,并呈现剂量依赖方式;HUVEC细胞划痕实验结果显示,Temporin-1CEa及其改造肽对HUVEC细胞划痕具有明显的抑制作用,其作用强弱顺序为:LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1。同时,Temporin-1CEa及其改造肽LK2(6)A(L)和LK1对HUVEC细胞Transwell迁移/侵袭和基质胶小管形成也具有显著的抑制作用,其作用强弱顺序为:Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成实验结果显示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能够抑制体内新生血管生成。综上所述,Temporin-1CEa及其改造肽对A375细胞具有显著的选择性杀伤作用,同时可以通过MMP-2和VEGF相关的机制抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,并具有显著的抗血管生成活性。这些研究结果有助于进一步对Temporin-1CEa进行结构改造,开发出具有抗黑色素瘤活性的抗癌肽用于临床治疗。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915

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本文编号：2540485