新型HSP90抑制剂筛选及抗胰腺癌增殖作用和分子机制研究 HSP90抑制剂诱导胰腺癌细胞IGF-1Rβ自噬性降解的分子机

发布时间：2019-10-08 14:44

【摘要】：胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤,由于早期难于诊断,局部侵袭力高、早期易转移以及对化疗产生抵抗的特点,导致胰腺癌病人的预后非常差。手术治疗的复发率达20-25%,术后主要采用化疗药物吉西他滨或／和5-Fu治疗。但是由于化疗药物毒性及耐药等缺点,导致胰腺癌患者的治疗效果不佳,5年生存率仍小于5%。由于胰腺癌的发生是一个多基因异常引起的复杂病理过程。因此,干预多条信号通路的新靶点药物可能具有更大的治疗前景。热休克蛋白90(HSP90)作为重要的分子伴侣,能够辅助蛋白折叠、装配和成熟,维持多种信号传导蛋白的稳定,从而保持细胞生长和存活。大多数已鉴定的HSP90的客户蛋白是癌蛋白。如：跨膜的酪氨酸激酶(HER-2、EGFR、IGFR),信号蛋白(AKT、c-RAF、P53、 V-src)细胞周期调节者(CDK4、CDK6)和转录因子(STAT3和HIF-la)等,这些癌蛋白直接参与胰腺癌的生长和血管生成。HSP90在包括胰腺癌在内的许多肿瘤细胞中高表达,可达正常细胞的2-10倍,可使肿瘤中过度激活或突变的癌客户蛋白保持活性和避免降解,从而加速肿瘤增殖和恶性转变。阻断HSP90的分子伴侣功能,能够使许多癌蛋白同时失去稳定性并降解失活,达到“一靶多效”的抗癌效果。而且肿瘤细胞中具有特定的HSP90活性超伴侣复合体结构,使HSP90抑制剂的亲和力比对正常细胞高出100倍,这使得HSP90成为备受关注的抗肿瘤新靶点。HSP90是同源二聚体,每个单体包括三个高度保守的结构域：N端与ATP结合结构域(P1-E245)、中间结构域(K246-D528)和C端二聚化结构域(G529-D723)。ATP与HSP90 N末端结合以及ATP被HSP90 ATPase水解驱动HSP90构象循环,维持HSP90的活性。目前,大多数HSP90抑制剂是针对其N末端ATP结构域设计,其中一些已经进入临床前或临床抗肿瘤研究。格尔德霉素类(GAs)是最早被发现的HSP90抑制剂,其中17-AAG是经典的HSP90 N末端抑制剂,具有很强的抗肿瘤活性(IC50N达10-8-9M)。然而GAs存在很多不足,如严重的肝脏毒性、依赖体内醌还原酶NQO1P450 CYP3A4的代谢活化及易产生耐药等,限制了其临床应用。随着化学结构和高通量筛选技术地迅猛发展,一些具有嘌呤骨架或间苯二酚结构的HSP90抑制剂被开发,女PU3、CCT018159和VER-52296等。晶体衍射和构效关系研究表明,具有间苯二酚异VA唑结构的VER-52296可以嵌入HSP90ATP口袋,可显著地降低癌蛋白c-RAF和HER-2等,从而发挥广谱的抗肿瘤增殖作用。然而,研究显示VER-52296对正常细胞具有同样的活性。在期临床研究中,一些注射VER-52296的实体瘤患者出现了恶心、呕吐、夜盲等不良反应。因此,这部分课题的研究目标是建立筛选N末端HSP90抑制剂的荧光偏振体系；对80个具有全新结构的间苯二酚衍生物进行HSP90亲和活性的筛选,并评价其对肿瘤细胞的生长抑制作用；对候选化合物Y306zh进行体内、外抗肿瘤药效学评价；并阐明Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制,为该类化合物的后续研发奠定坚实的实验基础。本研究工作由以下四部分内容组成：1)诱导并纯化人源重组HSP90a蛋白,建立用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系将pET24α(+)-HSP90a重组质粒转化至BL21(DE3),经1mM IPTG诱导蛋白表达,采用Ni-NTA亲和层析树脂纯化HSP90α蛋白。选用VER00051001为探针分子,检测不同浓度HSP90α蛋白或探针分子对荧光偏振值的影响,并采用HSP90抑制剂NVP-AUY922和GA验证荧光偏振体系是否建立成功。2)HSP90抑制剂的筛选随机地选择7种常用的人源性肿瘤细胞株,采用MTT法,对两批送样的具有间苯二酚三氮唑或异VA唑的80个化合物进行细胞毒检测。分别选取细胞毒活性较好的化合物,采用荧光偏振法对其与HSP90的亲和力进行初筛和复筛,得到候选化合物。其中,化合物Y306zh在酶学和细胞水平均显示出较好的活性,为此对其进行深入地抗肿瘤机制研究。3)候选化合物Y306zh的体内、外抗胰腺癌增殖作用研究采用MTT法,检测了Y306zh对15株人肿瘤细胞株的生长抑制作用,筛选出Y306zh的敏感瘤株为胰腺癌。并检测Y306zh对五株具有不同程度HSP90a表达的胰腺癌细胞和正常细胞的生长抑制作用。采用流式细胞术检测Y306zh对胰腺癌细胞周期阻滞,及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。在胰腺癌Mia-paca2细胞的裸鼠异体移植瘤实验中,通过检测荷瘤鼠体重、瘤体积和瘤重的变化,以及瘤组织中增殖指标Ki-67的阳性率,来评价Y306zh的体内抗胰腺癌作用。4)Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制研究采用荧光偏振技术检测Y306zh与HSP90 N末端的亲和力。采用ATP琼脂糖小球结合实验和免疫共沉淀实验分别检测Y306zh对胰腺癌细胞内ATP结合型的HSP90活性形式及HSP90与辅助分子伴侣p23、CDC37的相互作用。采用免疫印迹实验检测Y306zh对胰腺癌发生发展密切相关的两个重要客户蛋白EGFR和IGF-1Rβ的表达,及其下游PI3K/AKT和MAPK信号通路中关键分子蛋白表达的影响。预先给予蛋白酶体抑制剂MGl32,检测是否逆转Y306zh对客户蛋白EGFR、IGF-1Rβ、AKT、c-RAF和CDK4的降解作用。采用免疫共沉淀实验检测Y306zh诱导客户蛋白的泛素—蛋白酶体降解是否与HSP90-HSP70-CHIP-客户蛋白复合体的形成相关。综上所述,本课题取得的主要进展如下：1)采用pET24a(+)-HSP90a原核表达系统,成功地诱导表达并纯化了具有活性的HSP90a蛋白,建立并优化了用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系。2)从80个具有间苯二酚三氮唑或异VA唑结构的化合物中筛选出24个化合物,它们对肿瘤细胞生长抑制作用的IC50值在10-6-10-7M。并且绝大多数化合物(～20个)可与VER00051001竞争性结合HSP90,IC50值在10-7-10"8M。3)Y306zh是一种全新结构的有效的HSP90抑制剂,具有较好的体内、外抗胰腺癌作用,并且具有较好的肿瘤选择性和安全性。4)Y306zh可以通过抑制ATP与HSP90的结合,并阻碍p23与HSP90的相互作用,从而抑制HSP90的分子伴侣活性,导致胰腺癌中优势客户蛋白IGF-1Rβ和EGFR去稳定化,并抑制其介导的PI3K/AKT和MAPK两大增殖／存活信号通路,发挥抗胰腺癌增殖作用。
【图文】：

示意图,抑制剂,实体瘤,构象变化

有助于ＡＴＰ依赖的诸如ｃｄｃ３７、ｐ２３和免疫亲和素等其它辅助分子伴侣的相互逡逑作用，从而形成成熟的超伴侣复合体这种状态下，ＨＳＰ９０才能发挥其分子伴逡逑侣功能，促进其客户蛋白的构象成熟（如图３所示）。在肿瘤细胞中ＨＳＰ９０逡逑处于成熟的超伴侣复合体的活化状态，而在正常细胞中则主要处于未结合辅助分子逡逑伴侣的静息状态，使得ＨＳＰ９０抑制剂在肿瘤细胞中的亲和力比对正常细胞高出１００逡逑倍。因此，ＨＳＰ９０可成为选择性好的新型抗肿瘤药物靴点。逡逑恣心逡逑^+’邋凝逡逑ＡＯ巳＇。逦ＩｎｔｏｎｎｅＡａｔｅ逡逑寺ｉ逦龄逡逑管邋１逡逑Ｌａｔｅ邋Ｃ＜？７＾）ｌｅｘ逦Ａｓｙｍｍｅｔｎｃ邋Ｃｏｒｒ＾ｅｘ逡逑Ｃｉｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ邋ｅｔ邋Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ邋Ａｃｔａ邋馆ＢＡ）邋－邋Ｍｏｌｅｃｉｄａｒ邋ＣｅＵ邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ，邋２０１２．逡逑图３邋ＨＳＰ９０加工客户蛋白的构象变化示意图逡逑３、ＨＳＰ９０抑制剂逡逑ＨＳＰ９０抑制剂的出现为一系列实体瘤和血液系统恶性肿瘤的治疗开辟了新的途逡逑径，正在被广泛应用于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、慢性髓细胞性白血病、逡逑１３逡逑

模式图,荧光偏振法,侧冲,制剂

２．邋７．邋１确定反应体系中各组分的用量逡逑（１）确定ＨＳＰ９０ａ的用量逡逑在反应体系中给予足量的探针ＶＥＲ０００５１００１邋（终浓度８0１１＼１，５＾ｉＬ），设定不同逡逑的ＨＳＰ９０ａ蛋白浓度（０．０３３５、０．０６７、０．１００５、０．１３４、０．１６７５、０．２０１、０．３３５、０．５０３、逡逑０．６７０、０．８３８、１．００５、１．６乃帖／阵，每孔１阵），分别测定上述ＨＳＰ９０ａ蛋白浓度下的逡逑巧光偏振值（ＦＰ，，ｍＰ），根据反应曲线确定最适酶量。逡逑（２）确定探针的用量逡逑在反应体系中加入５呼终浓度为２．０１帖／ｍＬ的焌Ｐ９０ａ，在不同浓度的探针下（１０、逡逑２０、４０、６０、８０、１００、１６０ｎＭ），分别测定反应体系的ＦＰ值，根据反应曲线确定逡逑最适的探针用量。此外，根据公式计算已建立英光偏振体系的Ｚ’值和信噪比（Ｓ／Ｎ）。逡逑公式如下：逡逑Ｚ，＝！＿（邋３ｏｂｉｎｄｉｎｇ＋３ａｆｒｅｅ）／Ｉ邋＾ｉｂｉｎｄｉｎｇ—＾ｉｆｒｅｅ邋Ｉ邋；邋Ｓ邋／Ｎ邋＝邋（｜ｉｂｉｎｄｉｎｇ—｜ｊ，ｆｒｅｅ）／ａｆｒｅｅ逡逑（订为标准差，Ｈ为均值，ｂｉｎｄｉｎｇ；游离探针＋ＨＳＰ９０ａ，ｆｒｅｅ：游离探针）逡逑２．邋７．邋２巧光偏振法检测ＧＡ、ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２与ＨＳＰ９０ａ的亲和活性逡逑，入浓的阳（ＧＡ／ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２），
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

【参考文献】