二甲双胍通过激活AMPK通路降低同型半胱氨酸对内皮细胞的损伤

发布时间：2019-11-09 15:33

【摘要】：目的： 作为血管的保护伞，血管内皮细胞能使组织液和血液通过它完成物质代谢，而且血管内皮细胞也能产生并分泌生物活性物质用来调节凝血与抗凝平衡及血压等特殊功能，进而使血液流动正常和血管长期通畅。同型半胱氨酸能够使心血管疾病的发病率升高，这跟它诱导血管内皮细胞的损伤有关。作为一种降糖药物，二甲双胍被研究发现，可以使乳腺癌与心血管疾病的发病率降低，本实验旨在探讨二甲双胍能否降低同型半胱氨酸对血管内皮细胞的损伤及其可能存在的机制。 方法： ①观察不同溶度同型半胱氨酸（Hcy）作用血管内皮细胞后对细胞活性的影响将实验分为正常组、Hcy组，血管内皮细胞接种24小时后进行药物处理。Hcy组分别用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Hcy处理细胞24小时；用CCK-8试剂盒检测Hcy处理后的各组血管内皮细胞活性。 ②观察不同浓度二甲双胍（Metformin）作用血管内皮细胞后对细胞活性的影响将实验分为正常组、Merformin组，血管内皮细胞接种24小时后进行药物处理。Merformin组分别用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Merformin处理细胞24小时；用CCK-8试剂盒检测Metformin处理后的各组血管内皮细胞活性。 ③构建Hcy的血管内皮细胞损伤模型探讨Merformin的干预作用及其机制将实验分为正常组，Hcy组，Merformin组，Hcy+Merformin组。细胞接种24小时后药物处理。Hcy组加入1000μM溶度的Hcy，Merformin组加入1000μM溶度的Merformin，Hcy+Merformin组同时加入1000μM溶度的Hcy及1000μM溶度的Merformin，然后共同作用24小时。对各组进行以下方面检测：CCK-8检测各组血管内皮细胞活性，测定血管内皮细胞内乳酸脱氢酶（LDH）、总超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性和微量丙二醛（MDA）水平，qRT-PCR测定NADPHmRNA、SODmRNA及CATmRNA的表达，WesternBlot测定p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表达。 结果： （1）血管内皮细胞活性 ①与正常组比较，各溶度Hcy组血管内皮细胞活性低(P0.05)，且随着Hcy浓度的增加，血管内皮细胞活性下降。 ②与正常组比较，各溶度Merformin组血管内皮细胞活性无明显变化(P0.05)，且内皮细胞活性与Merformin浓度无关。 ③与正常组比较，Hcy组细胞活性低(P0.05)，Merformin组对细胞活性无明显影响(P0.05)，而Hcy+Merformin组较Hcy组细胞活性高(P0.05)。 （2）乳酸脱氢酶(LDH)活性 与正常组比较，Hcy组的细胞LDH活性高(P0.05)，Merformin组的细胞LDH活性无明显差异(P0.05)，Hcy+Merformin组LDH活性比Hcy组低(P0.05)，Merformin能降低Hcy导致的LDH活性的升高。 （3）细胞内总SOD活性 与正常组比较，Hcy组的细胞总SOD活性低(P0.05)，Merformin组的细胞总SOD活性无明显差异(P0.05)。Hcy+Merformin组总SOD活性比Hcy组高(P0.05)，Merformin能缓和Hcy导致的总SOD活性的降低。 （4）丙二醛(MDA)的生成水平 与正常组比较，Hcy组细胞MDA的生成水平高(P0.05)，Merformin组的细胞MDA的生成水平无明显差异(P0.05)。Hcy+Merformin组细胞MDA的生成水平生成水平比Hcy组低(P0.05)，Merformin能降低Hcy导致的细胞MDA的增加。 （5）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性 与正常组比较，Hcy组的谷胱甘肽过氧化物酶活性低(P0.05)，Merformin组的细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性无明显差异(P0.05)。Hcy+Merformin组谷胱甘肽过氧化物酶活性比Hcy组高(P0.05)，Merformin能缓和Hcy导致的谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。 （6）NADPHmRNA的表达量 与正常组比较，Hcy组的细胞NADPHmRNA的表达量高(P0.05)，Hcy+Merformin组细胞NADPHmRNA的表达量比Hcy组低(P0.05)，Merformin能降低Hcy导致的细胞NADPHmRNA的表达量的升高。 （7）SODmRNA的表达量 与正常组比较，Hcy组的细胞SODmRNA的表达量低(P0.05)，Hcy+Merformin组细胞SODmRNA的表达量比Hcy组高(P0.05)，Merformin能缓和Hcy导致的细胞SODmRNA的表达量的降低。 （8）CATmRNA的表达量 与正常组比较， Hcy组的细胞CATmRNA的表达量低(P0.05)，Hcy+Merformin组细胞CATmRNA的表达量比Hcy组高(P0.05)，Merformin能缓和Hcy导致的细胞CATmRNA的表达量的降低。 （9）p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表达量。 与正常组比较，各实验组的t-AMPKα蛋白的表达量无明显差异(P0.05)；与正常组比较，Hcy组的p-AMPKα蛋白的表达量无明显差异(P0.05)，Merformin组及Hcy+Merformin组的p-AMPKα蛋白的表达量升高(P0.05)。Merformin使细。胞内p-AMPKα/t-AMPKα的比值升高，从而使AMPKα的磷酸化水平升高。结论： ①同型半胱氨酸能使血管内皮细胞的活性降低，且随着同型半胱氨酸的增加，对血管内皮细胞的活性影响越大，其影响内皮细胞活性降低与诱导细胞内氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升，而使细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低有关。 ②Merformin对血管内皮细胞活性无明显影响(P0.05)，且内皮细胞活性与Merformin浓度无关。 ③二甲双胍可以降低同型半胱氨酸对内皮细胞的损伤，可能的机制是通过激动AMPK通路，使磷酸化的AMPK增加，从而缓和同型半胱氨酸诱导的细胞内氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低。
【图文】：

倒置显微镜下观察，EC304 细胞贴壁生长，，单个细胞形态可呈现三角形、梭型为主，细胞浆为透明、细胞核圆型，细胞生长融合后呈现铺路石样（图 1）。当细胞铺满 90%左右瓶底用含 EDTA 胰酶进行 1：3 传代。细胞传代后大约 40 分钟开始贴壁，大约 6-8 小时贴壁完全，刚贴壁时为圆形，约 12 小时成为梭形或多角形。36 小时后可长满 80%瓶底。

纯二甲双胍作用 24 小时后，CCK-8 检测细胞活性。%，其余各组细胞活性与正常组比较百分比为：，500 μM 组为 98.5±4.02%，1000 μM 组为 101.6±3.0.27%。通过统计分析发现，各浓度组与正常组比较细度无关（P>0.05）（见图 3）。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 王建华;李清;胡玉堂;;二甲双胍对高血压合并2型糖尿病患者血压及血脂的影响[J];现代中西医结合杂志;2008年24期

2 王红;杨春红;玛依拉;;二甲双胍对糖耐量减低患者血清炎症标志物的影响[J];现代医药卫生;2008年06期

本文编号：2558538