急性高原缺氧对药代动力学参数的影响及其药物转运体调控机制

发布时间：2019-11-20 12:57

【摘要】：【背景】我国每年进驻高原的人口总数达200万以上,但目前这部分高原人群发生疾病后的用药依然沿用平原用法用量,无高原用药标准,高原人群的用药安全很难得到保障,而高原药代动力学是高原合理用药、特别是安全用药的重要依据;目前国内外对于高原药代动力学的研究报道较少,特别是平原人群急进高原后,药物的药代动力学参数如何变化?目前尚不清楚;同时影响药动学参数改变的原因也很多,包括胃排空、血液流变学、心肺功能、肝肾功能、药物代谢酶、药物转运体等,而以往的研究主要集中于缺氧对肝药酶的影响,未见缺氧条件下对药物转运体的研究。药物代谢酶主要存在于肝脏,对于药物的吸收、分布排泄影响较小,而药物转运体是主动转运药物透过细胞膜进入体内和产生效应的关键因素,如MDR1、BCRP、MRP2、MRP3、OCT、OATP、OAT、PEPT等,其广泛存在于小肠的绒毛上皮细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞和胆管上皮细胞,在药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)各个环节发挥着重要作用,缺氧时药物转运体的变化可能是药物代谢酶更重要的影响药动学改变的因素,尤其是P-gp,其底物众多,分布广泛,在药物的吸收与转运中的作用十分重要。因此,研究缺氧条件下药物转运体的变化和其对药物ADME的影响,以及缺氧对其的调控机制,对于高原合理用药具有重要意义。【目的】研究急性高原缺氧对左氧氟沙星等药物药动学参数的影响,考察药动学重要影响因素药物转运体(P-gp)在缺氧时的变化,以及其变化后对左氧氟沙星在小肠中吸收的影响,探讨高原缺氧对P-gp的调控机制,为高原合理用药提供数据支持和理论依据。【方法】1.大鼠在平原口服给药后,经过7-10天的清洗期后急进高原再次给药,并增加平原急进平原组排除飞行应激的影响,比较平原与高原生理生化指标、左氧氟沙星药动学参数的差异,考察高原缺氧对于左氧氟沙星等药物药动学参数的影响。2.通过PCRarray芯片筛选出缺氧条件下大鼠小肠、肝脏、肾脏中差异性表达的药物转运体,并采用q RT-PCR,Western Blot验证各组织中差异显著、共性变化且作用广泛的药物转运体(P-gp)的表达,考察缺氧对药物转运体(P-gp)表达的影响。3.继第一部分用整体动物实验考察缺氧对药物整体药动学参数的影响后,通过大鼠在体单向小肠灌流模型、离体小肠外翻肠囊模型、Caco-2单层细胞模型,从整体动物—局部组织—细胞不同水平考察P-gp变化后,缺氧对其特异性底物左氧氟沙星在小肠吸收与转运的影响。4.在实验室前期高通量lnc RNA芯片筛选的缺氧差异性lnc RNAs基础上,通过慢病毒稳转干扰lnc RNA-H19在Caco-2细胞的表达,利用q RT-PCR,Western Blot的方法研究干扰后对P-gp以及其相关转录因子(HIF-1a、NF-κB、PXR、CAR)m RNA和蛋白水平的影响,预测H19的上游及下游靶基因,研究缺氧时H19对P-gp的调控作用。【结果】1.通过大鼠从平原急进平原(西安,海拔:450m)前后、平原急进高原(玛多,海拔:4380m)前后数据比较发现,急进过程即飞行应激对于大鼠的生理生化指标及左氧氟沙星的药代动力学参数无显著影响,而急性高原缺氧时,大鼠的血氧饱和度显著降低,肝肾功能显著受损,左氧氟沙星药动学参数显著改变,主要表现为AUC增加,Cmax增大,t1/2延长,CL降低。同时16种药物急进高原后的数据充分证明,急性高原缺氧显著影响药物的药动学参数,主要表现为吸收增加,代谢和排泄减慢的有10种吸收降低,代谢和排泄加快的有4种,药动学参数基本不变的有2种。结果说明急性高原缺氧对于药物的吸收、分布、代谢和排泄影响显著,高原药代动力学的研究对于高原合理用药十分必要。2.通过PCRarray芯片筛选发现急性高原缺氧可导致大鼠小肠、肝脏、肾脏中分别有5、18和8个转运体的m RNA相对表达量水平分别下降超过2倍,12、3和4个转运体的m RNA相对表达量水平分别上升超过2倍;q RT-PCR和Western blot实验发现PCRarray实验中变化倍数较大且作用最广泛的P-gp,在小肠中m RNA的相对表达量显著下调了50.80%,肝脏、肾脏中分别上调了1.15倍和49.00%;小肠中P-gp蛋白的相对表达量显著下调了71.30%,肝脏及肾脏组织中分别显著上调了1.33倍和1.83倍。实验表明影响药动学变化的主要因素—药物转运体在缺氧时发生显著变化,且具有组织特异性,会显著影响药物的吸收、代谢和排泄。3.急性高原缺氧时,P-gp的变化会使大鼠肠灌流液中30-60min、60-90min、90-120min、120-150min各时间段的肠壁渗透率Peff分别增加56.16%,2.26倍,77.74%和1.41倍;小肠外翻肠囊模型实验表明,缺氧可显著提高左氧氟沙星在十二指肠、空肠、回肠各段的吸收;Caco-2单层细胞模型实验中,缺氧后,左氧氟沙星A侧向B侧的转运速率减慢,而B侧向A侧的转运速率增加,缺氧显著增强了P-gp在Caco-2细胞中的外排作用。4.缺氧时P-gp的表达水平与lnc RNA-H19呈正相关,沉默H19后可显著抑制P-gp的表达,下调PXR与CAR的m RNA与蛋白水平表达,下调HIF-1a与NF-κB的蛋白表达水平,而对二者的m RNA表达水平无显著性影响,说明lnc RNA-H19是P-gp调控网络中的关键分子,通过在转录水平调控转录因子PXR、CAR、HIF-1a与NF-κB及转录后水平调控PXR、CAR的表达,形成对P-gp表达的调控网络。【结论】急性高原缺氧会显著影响左氧氟沙星等药物的药代动力学参数,影响其变化的重要因素是药物转运体在各组织的表达发生改变,尤其是P-gp的改变,可显著影响左氧氟沙星在小肠的吸收和转运;当沉默P-gp的上游基因lnc RNA-H19后,P-gp及其相关转录调控因子显著降低,初步说明lnc RNA-H19是MDR1调控网络中的关键分子,其可能是通过影响转录水平调控转录因子PXR、CAR、HIF-1a与NF-κB及转录后水平调控PXR、CAR的表达,形成对P-gp表达的调控网络。本研究为高原合理用药提供了数据支持和理论依据。
【图文】：

技术路线图

药物转运

图 1 药物转运体在体内膜定位（引用自：[24]Hasegawa M, Kusuhara H, Sugiyama D, et al..Functional involvement of rat organic anion transporter 3 (rOat3; Slc22a8) in the renal uptake of organicanions. J Pharmacol Exp Ther.）2.3. 药物转运体在药物 ADME 中的研究概况随着药物学家对药物转运体结构、功能及其在体内的分布及其相关转运机制的掌握，药物转运体已成功应用于许多临床实践。2.3.1 以药物转运体为靶点增加小肠吸收A. 设计成药物转运体的底物前体药物提高生物利用度药物吸收的部位主要在小肠，而小肠中存在多种药物转运蛋白，如 PEPT1、GLUTS、OAT、OA TP、P-gP 和 MRPs 等。他们对药物的吸收起着重要的作用，而很多药物的生物利用度不高，，如何提高其生物利用度颇受关注，其中以药物转运体为靶点来设计药物是其中的重点内容，目前也取得了较好的效果，研究较深入的转
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R969.1

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