软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性

发布时间：2020-02-10 08:24

【摘要】：目的:分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件,并对冬凌草甲素(oridonin,ORI)的抑瘤性和没食子酸乙酯(ethyl gallate,EG)促瘤性进行评价。方法:1)摸索实验条件:采用6孔板固态培养法,按不同密度(每孔500~20 000个)将肿瘤细胞系(Hela,K562和Hep G2)和转化细胞系(Bhas 42)与软琼脂混合铺板,计数克隆形成率。2)Hep G2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL~(-1)的ORI溶液混合后铺板;Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3μg·mL~(-1)的EG溶液处理后,镜下观察细胞达到转化状态后,与软琼脂混合铺板培养。经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。3)利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。结果:细胞接种密度为每孔1 000个左右时,利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低Hep G2细胞的克隆形成率(P0.01),且对细胞增殖有抑制作用。EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率(P0.01),但对细胞增殖影响不显著。结论:软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标,可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。两者的有机结合,可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。
【图文】：

⌒纬陕?=平均每孔细胞克隆数/每孔中加入的细胞数×100%）。1.2.4细胞接种密度的选择分别按每孔500、1000、2000、5000、10000、20000个的密度接种Hela、K562、HepG2及Bhas42细胞，其中Bhas42细胞分无处理组和PMA（50ng·mL-1）处理组，PMA采用0.1%DMSO现用现配，每组平行2孔。Bhas42细胞为可转化细胞，PMA处理组和下述的EG给药组细胞铺板前使用的Bhas42细胞均预先经PMA给药10d，此时镜下可观察到转化灶的形成（图1）。持续观察克隆形成情况，铺板、观察、计数方法同上。A.未转化（untransformed）B.转化（transformed）图1Bhas42细胞形态图Fig.1RepresentativeimagesofBhas42cells（10×10）1.2.5药物抑瘤性与成瘤性根据预实验结果确定HepG2及Bhas42细胞接种密度为每孔1000个。HepG2细胞设空白对照组（ddH2O）、溶媒对照组（0.1%和1%DMSO）、ORI（0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL-1）组；Bhas42细胞设空白对照组（ddH2O）、溶媒对照组（0.1%DMSO）、阳性对照组（PMA50、100ng·mL-1）、和EG（0.3、1、3μg·mL-1）组。ORI、PMA、EG溶液均采用0.1%DMSO配制，现用现配。制备上层琼脂时将相应浓度的药物、浓度为0.5×104个·mL-1的细胞液0.2mL、含20%FBS的2×细胞培养液2mL和0.7%琼脂糖2mL混合均匀后铺在底层琼脂上，每孔2mL，每组平行2孔。持续观察克隆形成情况，铺板、观察、计数方法

JournalofPharmaceuticalAnalysis药物分析杂志Chinese·448·药物分析杂志ChinJPharmAnal2017,37(3)图2软琼脂克隆形成实验细胞成瘤图例Fig.2Representativeimageofsoftagarcolonyformationassay表3冬凌草甲素对HepG2细胞克隆形成的作用（n=2）Tab.3EffectsoforidonintotheclonyformationofHepG2cells处理条件（treatment）平均克隆数（averagedclonecount）/·cm-2克隆形成率（cloneformationrate）/%ddH2O85820.1%DMSO74711%DMSO109104ORI0.016μg·mL-14442**ORI0.08μg·mL-13433**ORI0.4μg·mL-13231**ORI2μg·mL-11211**ORI10μg·mL-1109**ORI50μg·mL-144**与0.1%DMSO比较（comparedwith0.1%DMSO），**P<0.01表4冬凌草甲素对HepG2细胞周期的影响（n=3）Tab.4EffectsoforidonintothecellcycleofHepG2cells处理条件（treatment）G1期（phaseG1）/%S期（phaseS）/%ddH2O70.99±1.0727.20±1.960.1%DMSO72.82±3.1826.37±2.82ORI0.016μg·mL-172.85±2.1024.21±1.94ORI0.08μg·mL-186.94±0.0413.06±0.04**ORI0.4μg·mL-186.78±2.1913.22±2.19**ORI2μg·mL-183.68±2.2716.32±2.28**ORI10μg·mL-190.04±2.349.30±2.77**与0.1%DMSO比较（comparedwith0.1%DMSO），，**P<0.01

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