同源线粒体对小鼠线粒体功能障碍性肝损伤的治疗研究

发布时间：2020-02-13 23:36

【摘要】：线粒体疾病是由线粒体基因或核基因突变、线粒体膜或蛋白质受损引起的疾病。其主要影响患者脑,肌肉和心脏等组织。目前尚无特效药,现有治疗药物均是对症治疗。有文献报道,从线粒体功能障碍的源头出发,修复胞内突变基因,清除胞质蛋白积累毒性是治疗线粒体疾病的根本方法。但其可能存在实现难度较大,价格昂贵,副作用风险未知,进入临床应用困难等诸多问题。因此,本研究提出了用具有生物活性的线粒体替代功能障碍线粒体的治疗策略,制备了一种简便的线粒体注射剂用以探究同源线粒体对线粒体功能障碍性肝损伤小鼠的治疗作用。本研究中以小鼠对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)急性肝损伤模型和高脂性脂肪肝模型作为研究线粒体对功能障碍性肝脏疾病模型的治疗作用。本研究中同源线粒体取自昆明小鼠肝脏。所提取的线粒体形状良好,所制备的线粒体注射剂状态良好。JC-1测得了膜电位ΔΨm正常。使用线粒体选择性探针MitoTracker Red CMXRos染色,线粒体表现出明显的红色荧光,证明所制备线粒体注射剂中线粒体完整性良好。同时测定了实验所制备线粒体注射剂的稳定性。结果表明制备的线粒体制剂可用于进一步实验。MitoTracker Red CMXRos染色线粒体与绿色荧光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein,ECFP)标记线粒体(ECFP-Mito)经尾静脉注入正常小鼠体内。通过小动物活体成像仪确定MitoTracker Red CMXRos染色线粒体与ECFP-Mito线粒体在小鼠全身均有分布。再将小鼠各器包括脑、肺、肝脏、肾、心、脾、肌肉做冷冻切片。共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)拍照观察确定了MitoTracker Red CMXRos染色线粒体与ECFP-Mito线粒体在细胞内均有分布。选取健康雄性昆明小鼠60只随机分成5组,其中4组分别注射8 mg/kg剂量的线粒体作为实验组,第5组注射等量的0.01 M PBS作为正常对照组。线粒体注射组分别在1 h、8 h、24 h、72 h后水合氯醛麻醉,取脑、心、肝、肾、肌肉组织匀浆,分别测定各组织中腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的含量。结果证明8 mg/kg这一注射剂量对小鼠无明显生理毒性,可作为常用注射剂量。小鼠自发活动实验与游泳实验进一步证实了这一剂量的可行性。把所得带有绿色荧光蛋白ECFP的线粒体配成0.2 mg/mL的注射剂尾静脉注射到两只正常小鼠体内,2 h后处死,将肝细胞分离,流式细胞仪检测肝细胞ECFP-Mito的转化率。结果表明线粒体进入了多种组织细胞。在线粒体对APAP诱导的急性肝损伤模型小鼠的治疗实验中,将实验模型鼠随机分成两组,每组12只,另设等量正常对照组。其中一组APAP肝损伤模型组小鼠尾静脉注射0.8 mg/m L线粒体注射剂10 mL/kg,为治疗组,其余两组注射等量0.01 M PBS。12 h后取血和肝脏分别测定各小鼠血清测得治疗组谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和肝脏腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的量,再将各组肝脏做苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)拍照。结果证明,在APAP诱导的急性肝损伤模型研究中,治疗组小鼠AST、ALT、ATP、ROS、GSH的量与模型组和对照组相比存在显著性差异。HE染色显示模型组有较严重的浸润性损伤,治疗组小鼠较模型组小鼠肝损伤有很大改善。TEM图片显示,模型组线粒体均一致接近圆球形,而治疗组和同对照组相似的短杆状线粒体。在线粒体对高脂性脂肪肝模型小鼠的治疗实验中,治疗组每两天注射一次线粒体注射剂,共3次。余下两组每两天注射一次PBS,共3次。第6天分别测定各小鼠血清中AST、ALT、总胆固醇(total cholesterol,TC)和肝脏ATP、GSH、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、甘油三酯(triglycerides,TG)的量,再将各组肝脏做HE染色,油红O以及Mayer氏苏木素染色。测得治疗组小鼠AST、ALT、TC、ATP、GSH、SOD、MDA的量与模型组和对照组相比存在显著性差异;HE染色,油红O以及Mayer氏苏木素染色所得结果证明尾静脉注射线粒体对高脂性脂肪肝具有一定的改善效果。综上所述,本研究制备的线粒体注射剂经尾静脉注射后线粒体能够进入小鼠组织细胞内,且对小鼠无明显生理毒性。同时对小鼠APAP诱导的急性肝损伤模型小鼠和高脂性脂肪肝模型小鼠具有较好的改善效果。线粒体替代治疗可能是一种治疗线粒体功能障碍性肝损伤的新方法,从而为线粒体疾病的治疗提供一种新思路。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R965

【参考文献】