二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞（SW480）增殖及凋亡的影响

发布时间：2020-02-28 08:38

【摘要】：目的:(1)观察二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞(SW480)的增殖抑制作用及促进细胞凋亡作用,并探讨其可能的作用机制。(2)观察二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞(SW480)荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法:(1)体外培养SW480结肠癌细胞,通过MTT法检测不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)、柔红霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8?mol·L-1)以及不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)联合柔红霉素(0.2?mol·L-1)在不同时间(24h、48h、72h)对结肠癌SW480细胞增殖的影响,确定药物的浓度和作用时间。实验分为四组:空白组,二甲双胍组(20mmol·L-1),柔红霉素组(0.2?mol·L-1),二甲双胍与柔红霉素联合用药组(20mmol·L-1+0.2?mol·L-1),药物作用24h后检测相应指标:(1)MTT法检测细胞存活率;(2)集落克隆形成法检测细胞集落克隆形成情况;(3)碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染及Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率;(4)Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达;(5)RT-PCR检测细胞Bcl-2、Bax mRNA变化。(2)动物实验使用人结肠癌SW480细胞,建立移植肿瘤裸鼠模型:选取5-6周健康裸鼠,待细胞生长至对数期时,调整细胞浓度为1×107/ml,每只裸鼠左侧腋窝下注射细胞悬液0.2ml,将40只荷瘤小鼠随机分为4组:模型组(生理盐水NS),二甲双胍组(100mg·kg-1),柔红霉素组(0.1mg·kg-1),二甲双胍组与柔红霉素联合用药组(100mg·kg-1+0.1mg·kg-1),以上各组裸鼠腹腔注射给药,每只0.2mL,每隔3天给药一次,给药6次,处死裸鼠,检测相应指标。(1)测量瘤体大小,绘制成瘤曲线;(2)称量瘤体湿量,计算抑瘤率;(3)HE染色观察瘤体转移浸润情况;(4)TUNEL检测细胞凋亡情况;结果:(1)体外细胞实验:(1)MTT法检测显示,不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80mmol·L-1)、柔红霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8?mol·L-1)作用于SW480细胞24h、48h、72h后均可降低细胞的存活率。两者合用时,对细胞的生长抑制率明显增加,且抑制作用具有浓度、时间依赖性。20mmol·L-1二甲双胍作用于细胞24h、48h、72h后的存活率分别为66.35%、50.37%、42.02%。0.2?mol·L-1柔红霉素作用于细胞24h、48h、72h后的存活率分别为63.12%、48.13%、45.24%。二甲双胍与柔红霉素(0.2 mol·L-1)合用作用于细胞24h、48h、72h的存活率分别为60.63%、45.29%、32.16%。明显低于各单用组(P0.05)。(2)集落克隆结果显示,在经过结晶紫染色以后,克隆处显示为紫色斑点,而细胞经二甲双胍和柔红霉素单独用药及联合用药组处理后,与空白组比较,集落克隆形成数量均有所减少,差异有统计学意义(P0.05),进一步观察两者合用后,联合用药组与柔红霉素单用组比较,克隆形成的斑点减少更加明显,差异有统计学意义(P0.05)。(3)PI单染及Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测显示:SW480细胞的自发凋亡率极低,在用药以后,二甲双胍和柔红霉素单独作用于细胞后凋亡率增加,两者合用作用于细胞后,细胞凋亡率明显增加,与空白组比较差异均具有显著性(P0.05),与柔红霉素单用组相比,联合用药组细胞凋亡率明显增加,差异均具有显著性(P0.05)。(4)Western blot及RT-PCR结果显示,Bcl-2蛋白及mRNA的表达,与空白组比较,各组表达量减少,差异具有显著性(P0.05);与柔红霉素单用组比较,联合用药组表达量明显减少,差异具有显著性(P0.05);Bax蛋白及mRNA的表达,与空白组比较,其他各组表达量均增加,差异具有显著性(P0.05);与柔红霉素单用组比较,联合用药组表达量明显增加,差异具有显著性(P0.05);(2)动物实验:(1)联合用药组的瘤体积、生长与单用组比,生长缓慢,体积缩小,差异具有显著性(P0.05)。瘤体湿重及计算抑瘤率。结果显示,与模型组相比,柔红霉素组与联合用药组瘤重有明显减少,差异具有统计学意义(P0.05),与柔红霉素组相比,联合用药组瘤重减少的更明显,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)HE染色,在血管最丰富处即肿瘤的最外层,联合用药组同其他组相比,细胞正常区域较少,而坏死区域较多。(3)TUNEL检测凋亡细胞,镜下显示联合用药组细胞凋亡最为明显。结论:(1)二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌SW480细胞增殖有抑制作用并能促进细胞凋亡,其作用机制可能与促进Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达有关。(2)二甲双胍联合柔红霉素对SW480结肠癌荷瘤裸鼠有抗肿瘤增长作用,其机制可能与促进凋亡有关。
【图文】：

图 2-1 药物对细胞增殖抑制作用( x ±s，n=5)A.二甲双胍 B.柔红霉素 C.二甲双胍联合柔红霉素Fig.2-1 The effect of drugs on cell proliferation( x ±s，n=5A.Metformin B. Erythromycin C. Metformin and Erythromy肠癌细胞 SW480 集落克隆形成的抑制作用多的了解二甲双胍和柔红霉素单独使用或者是联合用80）在增殖方面的影响，在实验中，我们根据 MTT 实细胞，运用集落克隆形成实验的检测方法，，进一步观察80）增殖抑制作用的影响。由结果，我们可以看出，在处显示为紫色斑点，而细胞经二甲双胍和柔红霉素单后，与空白组比较，集落克隆形成数量均有所减少，差进一步观察两者合用后，联合用药组与柔红霉素单用

-2.药物对结肠癌细胞SW480集落克隆形成的影响
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2583414