基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究

发布时间：2017-03-21 03:06

  本文关键词：基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,人类生存环境改变,在一些不利的外部环境作用下,肿瘤的发病率正在逐步上升,成为严重威胁人类健康、高死亡率的常见疾病。化学治疗是临床上治疗肿瘤的最常见和有效的策略。然而,肿瘤多药耐药(MDR)已成为临床化疗失败的重要原因,故抗耐药研究和发现耐药逆转剂成为抗肿瘤研究的重要方面。来源于自然界的动植物、微生物以及海洋生物的天然药物是新药研发的重要源泉。多酚化合物是存在于自然界的最为普遍的天然化合物,双联苄(Bisbibenzyl)是苔鲜植物中特有的一类天然多酚类化合物,具有昆虫拒食、抗微生物、抗氧化、抗真菌、细胞毒、植物生长调节和抗血小板凝集等显著而广泛的生物学活性。近期研究报道表明,双联苄化合物可以作用于P-糖蛋白、环氧合酶等靶点产生生物学活性。目前,已从苔鲜植物中分离得到了许多具有耐肿瘤多药耐药的活性化合物。本论文的研究对象之一Dihydroptychantol A (DHA)是山东大学天然药物研究所从苔藓植物狭叶花萼苔中得到的新型联苄化合物。该化合物已经被全合成,同时也证实了其抗真菌活性。为了研究该化合物的其他生物活性,我们首先利用多种多药耐药细胞株和其亲本的敏感细胞株,用MTT法筛选了包括双联苄在内的多个多酚化合物的逆转肿瘤多药耐药作用,结果发现DHA的细胞毒性较低(对K562/A02、K562细胞株的IC50均大于40μM),却能明显逆转多药耐药肿瘤细胞株对阿霉素的耐药性。随后,我们进一步展开了DHA在体外逆转MDR作用机制的研究。以多药耐药的阿霉素抗性的K562/A02细胞为试验对象,研究了DHA及其衍生物(化合物1-3)的抗肿瘤活性。MTT试验结果表明,DHA在四种化合物中的抗肿瘤活性是最强的；流式细胞仪检测结果表明,不同浓度的DHA处理K562/A02细胞后,阿霉素和罗丹明123在K562/A02细胞中的累积明显增加。同时还减少了罗丹明123的泵出量,说明DHA抑制了P-gp的外排泵功能。用流式细胞仪和RT-PCR对P-gp的表达进行分析。结果发现DHA处理K562/A02细胞24小时,P-gp蛋白表达和MDR1 mRNA的表达均减少,具有浓度依赖性。但DHA对其亲本细胞K562细胞无明显影响。以上试验结果证实,DHA能够有效地逆转肿瘤多药耐药,该作用与其抑制P-gp的功能、蛋白表达和降低MDR1 mRNA水平有关。本论文的另一部分内容是研究从中药茄属类植物龙葵中分离得到的甾体生物碱类化合物龙葵碱Solamargine(SM)单体对多药耐药细胞生长的抑制作用及机制探讨,结果发现该化合物具有高效低毒的特点。这一部分实验观察了化合物SM对三种耐药细胞K562/A02, KB/VCR和H460/paclitaxel (Taxol)的细胞毒性和相关机制。MTT结果显示,SM能明显抑制三种耐药细胞株的增殖,与对应的敏感细胞株K562,KB和H460相比具有相同甚至更敏感的生长抑制作用。DAPI核染色和流式细胞术实验结果发现,SM可显著促进耐药K562/A02细胞凋亡。RT-PCR结果显示SM能够下调MDR1的mRNA水平,同时采用流式细胞术检测发现SM能够抑制P-gp的表达水平。此外,蛋白印记实验结果显示SM处理的耐药细胞中bcl-2和actin蛋白表达降低,bax蛋白表达升高。以上结果提示SM能够明显诱导MDR肿瘤细胞的凋亡,这与肌动蛋白裂解和MDR1表达下调有关。这种化合物值得作为一种可以绕过MDR机制的用于治疗MDR肿瘤的潜在药物进行深入的研究。天然药物在癌症的化疗中扮演着非常重要的角色。本论文的两种天然产物DHA和SM都具有抗肿瘤多药耐药作用,但机制不同,都是具有潜在开发价值的抗癌先导物,值得更进一步的研究。
【关键词】：双联苄化合物 龙葵碱 多药耐药 p-糖蛋白 凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要11-13
• ABSTRACT13-16
• 缩略词说明16-18
• 第一章 前言18-28
• 1 研究背景18-19
• 1.1 肿瘤耐药是临床化疗失败的最主要原因18
• 1.2 肿瘤耐药的主要发生机制18-19
• 2 肿瘤细胞产生多药耐药的主要靶点机制及途径19-24
• 2.1 P-gp是肿瘤细胞产生多药耐药的主要靶点机制19-21
• 2.2 基于P-gp为靶点的抑制剂是逆转肿瘤多药耐药的有效途径之一21-22
• 2.3 多酚类中的双联苄化合物以P-gp为靶点发挥逆转肿瘤多药耐药的作用22-24
• 3 天然产物库是发现肿瘤耐药逆转剂的宝库24-28
• 3.1 双联苄化合物25-27
• 3.2 龙葵碱27-28
• 第二章 双联苄类化合物DHA逆转肿瘤多药耐药及其机制的研究28-43
• 1 实验材料28-30
• 1.1 细胞株28
• 1.2 药品及试剂28-29
• 1.3 主要仪器设备29-30
• 2 实验方法30-32
• 2.1 细胞毒性和多药耐药逆转试验30-31
• 2.2 细胞内阿霉素蓄积实验31
• 2.3 RT-PCR方法检测MDR1的mRNA表达31
• 2.4 流式细胞仪检测细胞P-gp蛋白表达31
• 2.5 细胞内罗丹明123的蓄积与泵出试验31-32
• 2.6 细胞松弛素B预处理后DHA对细胞内罗丹明123蓄积的影响32
• 2.7 数据分析32
• 3 实验结果32-40
• 3.1 DHA及其衍生物对阿霉素细胞毒性的影响以及细胞耐药逆转效应32-35
• 3.2 DHA增加细胞内阿霉素的蓄积浓度35-36
• 3.3 DHA降低P-gp的表达36-38
• 3.4 DHA对细胞内罗丹明123蓄积和泵出的影响38-39
• 3.5 细胞松弛素B预处理后DHA对细胞内罗丹明123蓄积的影响39-40
• 4 讨论40-43
• 第三章 龙葵碱SM对多药耐药肿瘤细胞生长的抑制作用及机制研究43-56
• 1 实验材料43-44
• 1.1 细胞株43
• 1.2 化学试剂43-44
• 1.3 试剂配制44
• 1.4 实验仪器44
• 2 实验方法44-49
• 2.1 细胞毒性实验44-45
• 2.2 DAPI染色检测细胞凋亡45
• 2.3 流式细胞仪检测细胞调亡45
• 2.4 蛋白印迹法检测蛋白表达水平45-48
• 2.5 流式细胞仪检测P-gp蛋白表达48
• 2.6 RT-PCR法检测MDR1的mRNA表达水平48-49
• 2.7 免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白actin表达水平49
• 2.8 统计分析49
• 3 实验结果49-54
• 3.1 SM抑制多药耐药肿瘤细胞增殖49-50
• 3.2 SM诱导耐阿霉素的K562/A02细胞发生凋亡50-51
• 3.3 SM抑制K562/A02细胞P-gp的表达51-53
• 3.4 SM抑制K562/A02和KB/VCR细胞中actin的表达53-54
• 4 讨论54-56
• 第四章 全文结论56-57
• 参考文献57-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表的论文66-67
• 附件67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 芦颖;李庆华;庞天翔;;肿瘤细胞内pH值改变与肿瘤多药耐药的关系[J];中国药理学通报;2007年09期

  本文关键词：基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：258913