人脐带间充质干细胞培养上清的免疫抑制作用研究

发布时间：2020-03-22 05:33

【摘要】：目的：研究人脐带间充质干细胞培养上清对正常人外周血单个核细胞（PBMC）各淋巴细胞亚群比例的影响；探究人脐带间充质干细胞培养上清对诱导活化后的PBMC杀伤肿瘤细胞功能的影响。方法: 一．人脐带间充质干细胞的分离、培养和生物学特性研究。利用组织块贴壁法分离人脐带间充质干细胞并利用传代纯化筛选出能稳定传代培养的hUC-MSC；倒置荧光显微镜观察细胞形态；流式细胞术（FCM）检测hUC-MSCs的免疫表型；应用不同因子诱导hUC-MSCs向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化并进行鉴定。二． hUC-MSCs对正常人外周血单个核细胞（PBMC）各淋巴细胞亚群比例的影响的研究。通过密度梯度离心法分离PBMC，加入OKT3刺激，，用含有hUC-MSCs培养上清的条件培养基（MSC-CM）处理PBMC， FCM分析比较处理组和对照组各淋巴细胞亚群比例以及周期的变化；Annexin V/PI双染确定PBMC的凋亡情况；ELISA法检测MSC-CM对PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影响。三． PGE2参与hUC-MSCs对Treg亚群比例的调节并影响PBMC的增殖活性。在hUC-MSCs的培养体系中加入PGE2拮抗剂NS-398并收集培养2~3d后的hUC-MSC上清。用含此时收集的hUC-MSC上清的条件培养基作用于PBMC，作为实验组，用含未处理过的hUC-MSCs培养上清的条件培养基作用于PBMC，作为对照组1，用正常DMEM/F12培养基作用于PBMC，作为对照组2。FCM分析比较实验组和各对照组PBMC中Treg比例的变化；ELISA法检测比较实验组和各对照组PBMC分泌IFN-γ、IL-10的水平。四． hUC-MSCs上清与CIK及肿瘤细胞A549共培养体系的相互作用研究。密度梯度离心法分离PBMC，并诱导培养CIK细胞，流式细胞术检测CIK细胞免疫表型；流式细胞术检测hUC-MSCs培养上清作用后A549细胞周期的变化，MTT法检测A549细胞增殖曲线；MTT法检测hUC-MSCs培养上清对CIK杀伤A549细胞的影响。结果：成功分离得到人脐带间充质干细胞，体外培养细胞贴壁、呈长梭形，形态均一，高表达基质细胞标志CD73、CD105、CD44、CD29和黏附分子CD90，不表达CD14、MHCⅡ类分子HLA-DR和造血干细胞表面标志CD34、CD45，Gomori钙钴法、油红O染色和阿利辛蓝染色证实分离所得脐带间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞；MSC-CM下调了CD4+/CD8+T细胞比值，上调了PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的含量，而对其他淋巴细胞亚群的比例无显著影响，抑制了PBMC分泌IFN-γ的能力，但对IL-10的分泌有促进作用，此外，MSC-CM对PBMC有保护作用，降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。抑制剂NS-398的加入使MSC-CM上调Treg的能力下降，同时也抑制了上调PBMC分泌IL-10的能力，且使PBMC分泌IFN-γ的水平得到恢复，NS398抑制试验确定了PGE2是人脐带间充质干细胞培养上清发挥免疫抑制效应的介导因子；杀伤试验证实人脐带间充质干细胞对CIK的杀伤功能具有抑制作用，且此抑制作用可能被血清中和。结论：人脐带间充质干细胞的免疫抑制效应可不依赖于与免疫细胞的直接或间接接触，并且与诱导免疫细胞凋亡无关，通过可溶性因子PGE2促进Treg细胞的增殖和活化可能是人脐带间充质干细胞发挥其免疫抑制功能的途径之一，且此种抑制效应能够降低CIK细胞对肺腺癌A549细胞的杀伤功能。
【图文】：

分离培养,人脐带,间充质干细胞,贴壁细胞

3 结果3.1 hUC-MSCs 的分离培养和形态学观察通过组织块法分离培养人脐带间充质干细胞，可在分离培养的 10d 内于倒置显下观察到呈梭行、多角形或短杆状的贴壁细胞从组织块周围爬出（图 1.A）。10胞增长速度逐渐加快，向远离组织块方向呈放射状生长，细胞逐增生为形态均

颗粒沉积,成骨细胞,培养过程,细胞形态

图 2. hUC-MSCs 的免疫表型检测Fig2. The test of immunophenotype of hUC MSCs hUC-MSCs 的分化潜能和鉴定.1 向成骨细胞诱导及其鉴定在成骨定向诱导培养过程中，观察到诱导细胞体积逐渐增大，细胞间隙逐渐细胞形态逐渐由长梭形向短梭形、鳞片型、多角形等形态转变，且常伴有短相连，轮廓清晰，多位于细胞的游离端。诱导后期可观察到细胞中部出现结，部分细胞层叠生长，细胞胞浆中形成大小不一的颗粒沉积，而对照组仍为形细胞形态，胞浆中也无颗粒沉积（图 3.A）。经 Gomori 钙钴法染色颗粒会到棕黑色（图 3.B），大部分细胞染色呈阳性，符合成骨细胞的特征，由此我分离所得 hUC-MSCs 具有向成骨细胞分化的能力。.2 向脂肪细胞诱导及其鉴定在成脂定向诱导培养过程中，发现加入成脂诱导液后细胞几乎停止增长，5
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】