大肠杆菌K4尿苷二磷酸葡萄糖4位异构酶（KfoA）底物选择性及其机制的初步研究

发布时间：2020-03-27 14:57

【摘要】：糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是一种具有较高负电荷的直链多糖,常以游离状态存在于细胞质中或通过共价键与核心蛋白结合后以糖蛋白的形式锚定于细胞表面。在多种蛋白质受体或者趋化因子辅助下,GAGs在细胞粘附,炎症反应,发育等许多生理过程中发挥着至关重要的作用。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)作为GAGs的一个重要分支,因其高黏度和低压缩性等独特的流变学特性,使之成为理想的关节腔和眼部润滑液成分,已被广泛用于临床中关节炎及干眼病的治疗。目前,市售的CS多由动物组织中分离提取所得,这种生产CS的工艺流程存在许多缺点,容易造成产物结构不均一、杂质污染等问题,这明显制约了 CS作为药物在临床应用中的发展。因此,开发非动物来源生产工艺,高效生产出结构均一的CS是非常迫切的。E.coli O5:K4:H4(ATCC 23502)是一种尿路致病性大肠杆菌,属于2型E.coli,其荚膜多糖通常被称为K4CPS。该荚膜多糖是由带着果糖支链(果糖以β键连接在葡萄糖醛酸(GlcA)的C-3位上)的软骨素重复二糖单元葡萄糖醛酸β(1-3)-N-乙酰氨基半乳糖β(1-4)(GlcA β(1-3)-GalNAc β(1-4))构成,是一种潜在的软骨素发酵生产菌株。然而野生型菌株的多糖产量一般较低,并不能满足商业化生产需求,所以研究K4CPS合成基因簇所编码的多糖合成关键酶,对于提高K4多糖微生物发酵产量和开发新的化学酶法合成CS途径有着重要意义。目前,E.coli O5:K4:H4的全基因组已经完成,其中,K4CPS合成基因簇所编码的KfoA的生物化学特征并未被明确研究过。然而,经过KfoA(登录号CCQ00728.1)序列与大肠杆菌中普遍存在的尿苷二磷酸葡萄糖4位异构酶(UDP-Glc-4-epi)GalE-E.coli(登录号CCQ02734.1)序列进行氨基酸序列比对发现,KfoA与GalE-E.coli具有约60%的相似性。于是我们假设,在K4CPS合成过程中,KfoA通过将尿苷二磷酸N乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)4位异构的形式,负责尿苷二磷酸N乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)的提供,所以本课题对KfoA的底物选择性及其机制进行了体外研究。首先通过体外构建pET28a(+)-His-KfoA重组表达系统,实现了 KfoA的体外可溶性高效表达,建立了稳定的分离纯化步骤,获得了大量KfoA蛋白。并且建立了毛细管电泳离线检测法,确定了体外重组表达KfoA的UDP-GlcNAc/Glc 4位异构酶(UDP-GlcNAc/Glc-4-epi)活性。其次,为解决由于这四种尿苷二磷酸单糖的结构差异甚微而造成的检测困难,本课题建立了两种新型快速检测法:基于毛细管电泳在线检测EMMA法原理建立的UDP-G1cNAc/Glc-4-epi活性检测法和偶联软骨素合酶KfoC的乙酰化底物(UDP-GlcNAc)4位异活性检测法。这两种新型活性检测法的建立使检测更加便捷,实现了活性检测的高效率,低成本。并且KfoA(或GalE-E.coli)和KfoC偶联的体外催化反应在一定程度上模拟了 K4CPS的体内延伸过程,这使得我们在验证KfoA活性的同时,提供了 KfoA是K4CPS体内生物合成过程中比GalE-E.coli更高效生成UDP-GalNAc的催化酶的直接证据。最后,通过酶促动力学及转化率实验,验证了相比于UDP-glucose,体外重组表达的KfoA对于乙酰化的核苷酸活化单糖(UDP-GlcNAc)表现出明显的底物偏好性。并且,在以UDP-GlcNAc为底物时,其催化效率、亲和力及最大反应速率均要大于GalE-E.coli。然而通过KfoA与尿苷二磷酸葡萄糖4位异构酶(UDP-Glc-4-epi)家族即GalE家族成员进行氨基酸序列比对发现,相比于各亚型E.coli中共有的UDP-Glc-4-epi,KfoA与GalE家族group 2组成员(homo-GalE和Gne-B7)的氨基酸序列相似度最高,同源性最好。然而该酶对于乙酰化底物(UDP-GlcNAc)却有着强烈的偏好性,这种底物选择性却与group 3成员更为相似。所以,为了探究KfoA这种独特底物偏好性的分子机制,本课题通过KfoA与GalE家族其他成员的氨基酸序列分析后,对特定氨基酸位点突变,进而对各突变体与野生型KfoA转化率实验的研究,确定了 KfoA乙酰化底物偏好性的关键氨基酸。最终通过蛋白质同源建模与分子对接等生物信息学手段分析,初步揭示了相关氨基酸位点影响KfoA底物选择性的分子机制。综上所述,本课题在体外成功的重组表达了大肠杆菌K4CPS合成基因簇所编码的 UDP-Glc-4-epi KfoA,确定了其 UDP-GlcNAc/Glc-4-epi 活性。并且建立了两种新型快速检测UDP-GlcNAc/Glc-4-epi活性的方法,实现了活性检测的高效率,低成本。最后通过酶促动力学及转化率实验,联合蛋白质同源建模与分子对接等生物信息学手段,发现了 E.coli 05:K4:H4中UDP-Glc-4-epi KfoA对于乙酰化底物(UDP-GlcNAc)具有强烈的偏好性,确定了其在K4CPS合成中的关键作用,并初步揭示了相关氨基酸位点影响KfoA底物选择性的分子机制,为后续包括KfoA在内的GalE家族工具酶分子的改造提供了理论依据。
【图文】：

图１－２大肠杆菌Ｋ４荚膜多糖合成示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋Ｋ４ＣＰＳ逡逑

大肠杆菌K4尿苷二磷酸葡萄糖4位异构酶（KfoA）底物选择性及其机制的初步研究

图1-3两步放射法测定UDP-GIe-4-epi活性〔幸表示被aH标记)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914

【相似文献】