基于分子识别的“开关型”肿瘤光动力学治疗纳米体系研究

发布时间：2020-03-29 02:48

【摘要】：肿瘤严重威胁着人类的健康,目前对肿瘤的主要治疗方法有手术治疗、化学治疗和放射治疗。肿瘤光动力学治疗(Photodynamic therapy,PDT)是在特定激发光的照射下,光敏剂(Photosensitizer,PS)将能量高效转移至氧气,产生活性氧(ROS)杀死癌细胞的治疗方法,因其治疗的温和性、非侵入性以及副作用小等优点成为研究热点。但肿瘤PDT仍存在着一些问题,如多数PS水溶解性差、小分子光敏剂难以穿过体内的重重生物学屏障,难以实现在其作用靶点的高效分布、光敏毒性、肿瘤微环境降低PDT效率等,因此肿瘤PDT治疗效率的提高及光敏毒性的降低是目前PDT亟待解决的关键问题。目前肿瘤PDT研究主要集中在PS的肿瘤靶向转运、PDT治疗肿瘤的作用机制以及与其它治疗方式的协同作用等。基于此,本课题拟构建一种基于分子识别作用的肿瘤细胞激活的PDT体系,在提高肿瘤PDT效率的同时,采用分子激活“开关”的理念,降低PDT的光敏毒性。近年来二氧化锰(MnO_2)因其粒径可控,具有ROS猝灭作用,可与还原性谷胱甘肽(GSH)反应,催化过氧化氢产生氧气等性质越来越多的用于药物纳米载体的研究。第二代PS,血卟啉单甲醚(HMME),性质比较稳定,光敏化力强且毒性低及在机体内代谢比较迅速等优点,在临床上被广泛用于肿瘤的PDT。特定序列的核酸适配体(Aptamer,APT)对肿瘤细胞具有靶向作用。为使PDT体系具有“开关”效应,本研究利用介孔二氧化锰纳米粒(MMnNPs)对PS的高效ROS产生猝灭作用,构建PDT的“开关”,为实现PDT体系肿瘤特异性激活,我们采用兼具分子识别及构象变化能力的发卡状APT作为PDT体系“开关”的智能“感应器”。该PDT体系在正常组织时,发卡状APT无识别作用,不能发生构象变化,HMME不能成功释放,处于MMnNPs中,此时为猝灭状态,避免光敏毒性;在肿瘤组织时,发卡状APT识别MCF-7细胞表面的MUC-1蛋白,构象发生变化,HMME释放,此时由于肿瘤中高浓度的过氧化氢,在载体二氧化锰的催化下产生自由氧,为ROS的产生提供氧气来源,同时,MnO_2消耗细胞内的GSH,减少其对产生的ROS的影响,扫清肿瘤PDT的上下游障碍,高效治疗肿瘤。本课题采用超声重结晶的方法实现MMnNPs高效装载HMME,载药率高达88.7%,将能与乳腺癌(MCF-7)细胞表面的标志物膜蛋白(MUC-1)互补的,连接巯基的发卡状APT作为门控分子封堵MMnNPs的孔道,同时实现靶向MCF-7细胞及智能激活PDT的特性,对该制剂(MMnNPs/HMME-DNA)进行表征,考察了其形态、粒径电位、XPS、孔径以及作为“开关型”材料的可行性等。TEM结果表明MMnNPs粒径均匀,200 nm左右;XPS结果表明Mn离子的价态为+4价;通过氮气吸附可知MnO_2比表面积为123.9982 m2/g、平均孔径为3.23039 nm,孔径大小合适,具有装载药物的能力;通过对HMME产生ROS的影响实验结果显示,MnO_2对HMME产生ROS具有猝灭作用;药物释放实验结果表明,只有在MUC-1蛋白存在时,孔道才能被打开,HMME才能释放。综合以上实验结果,表明已成功构建具有开关特性的MMnNPs/HMME-DNA。选用人乳腺癌细胞MCF-7为实验对象,正常乳腺细胞Hs578Bst为对照实验组,对MMnNPs/HMME-DNA肿瘤PDT体系在532 nm激光照射下进行体外抗肿瘤活性研究。结果表明,载体材料MnO_2在使用剂量下对两种细胞生长无明显抑制作用,而制剂对MCF-7细胞的生长抑制作用明显,对Hs578Bst细胞生长无明显抑制作用。与游离HMME相比,MMnNPs/HMME-DNA组对MCF-7的生长抑制作用显著提高;摄取实验结果表明,MCF-7细胞中MMnNPs/HMME-DNA组在细胞质中有很强的红色荧光分布,表明MMnNPs/HMME-DNA可在MCF-7细胞中释放出HMME,而Hs578Bst细胞中红色荧光微弱,说明HMME不能在Hs578Bst细胞中释放;凋亡实验对比制剂组MCF-7和Hs578Bst,结果表明MCF-7组凋亡率明显高于Hs578Bst组,而HMME组两种细胞凋亡率无明显差别,说明所制备的制剂对MCF-7和Hs578Bst具有较好的选择性;从检测细胞GSH含量变化可以看出,该载体系统可以降低细胞内GSH的含量,用于改善肿瘤的治疗。在体内抗肿瘤活性实验中,选用MCF-7对裸鼠构建荷瘤裸鼠模型动物,主要对MMnNPs/HMME-DNA进行动物体内抗肿瘤活性考察。组织分布与游离IR783组相比,MMnNPs/HMME/IR783-DNA组能延长IR783在裸鼠体内的循环时间,具有较好的靶向作用,使IR783高效聚集在肿瘤部位;免疫荧光结果表明MnO_2可以在一定程度上改善肿瘤缺氧的状况;体内抗肿瘤活性实验结果表明,基于MMnNPs/HMME-DNA的“开关型”PDT体系能够有效抑制肿瘤生长,效果明显优于游离HMME给药组;TUNEL凋亡研究结果进一步证明了该给药系统能够有效抑制肿瘤生长,对肿瘤组织细胞具有促进凋亡的作用;对肿瘤组织GSH的含量进行检测,与生理盐水组对比,结果表明肿瘤组织GSH的含量降低接近50%。综上所述,MMnNPs/HMME-DNA肿瘤PDT体系的体内外研究结果表明,APT使该PDT体系实现了“开关可控”以及HMME在肿瘤组织的特异性释放,在激光照射下能高效产生ROS,特异性杀伤肿瘤细胞,有望应用于肿瘤治疗。
【图文】：

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图 1. 1 MMnNPs/HMME-DNA 作用示意图Fig 1.1 The schematic diagram of MMnNPs/HMME-DNA interaction

示意图,示意图,介孔结构,纳米粒

图 2. 1 MMnNPs 的合成示意图Fig 2.1 The schematic illustration of MnO2nanocomposite preparation3.2 载体 MMnNPs 的表征结果3.2.1 透射电子显微镜结果（TEM）图 2.2 为载体材料 MMnNPs 的透射电镜图，从 TEM 图中可以看到 MnO2呈球形，边缘不规则，结构疏松，有明显介孔结构，为药物的装载提供基础，且MnO2纳米粒的粒径均匀，，200 nm 左右，具有 EPR 效应，此纳米载体的介孔结构可用于药物的装载，因此该纳米粒可作为药物载体。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【参考文献】