长效性PAI-1抑制剂的设计及分子药理活性研究

发布时间：2020-04-08 15:59

【摘要】：纤溶酶原激活物抑制剂 1(Plasminogen activator inhoibitor-1,PAI-1)是纤溶系统的一个重要的负控调节因子。PAI-1能够快速的抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-typeplasiminogen activator,uPA)和组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasiminogen activator,tPA)的活性来抑制纤维蛋白溶解过程。PAI-1表达量升高与心脑血管等疾病的发生密切相关,研究表明通过抑制体内PAI-1活性已成为血栓栓塞性疾病治疗的新策略。因此,开发新型PAI-1抑制剂己成为本领域研究的热点。本论文包括二个部分;在本论文第一部分中,基于之前设计的蛋白类PAI-1抑制剂(PAItrap),为了延长其半衰期,我们将PAItrap与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合形成一种新型长效性PAI-1抑制剂。但是,融合蛋白PAItrap-HSA对PAI-1的亲和力下降了 3倍与PAItrap相比(33nM～10nM)。因此,我们采用理论计算方法进一步优化PAItrap的抑制能力。经过实验筛选获得一个高亲和力突变体,命名为PAItrap(H37R)-HSA,相对于 PAItrap-HSA 抑制能力提高了 6 倍(5nM～33nM),相对于PAItrap半衰期延长200倍。我们采用血块溶解实验,证明了 PAItrap(H37R)-HSA能够通过抑制内源性或者外源性PAI-1促进血栓的溶解。为了能够适用于小鼠模型研究,我们检测了PAItrap(H37R)-HSA 对鼠源 PAI-1 的抑制能力(IC50=12nM)。在激光损伤诱导血栓形成小鼠模型中,我们观察到PAItrap(H37R)-HSA有效阻碍了血栓的形成和血小板的聚集。并且在小鼠尾部出血实验中,发现PAItrap(H37R)-HSA没有影响小鼠全身性的凝血功能。这些结果表明,PAItrap(H37R)-HSA是一个安全有效的PAI-1抑制剂,能够抑制血栓的形成或者加速内源性血栓溶解。在本论文第二部分中,基于PAI-1·tPA米氏复合物晶体结构,结合PAItrap设计的原理,我们将tPA的非活性丝氨酸蛋白酶结构域改造成一种全新的蛋白类PAI-1抑制剂,它通过与PAI-1结合形成稳定的米氏复合物而阻止PAI-1对活性u/tPA的抑制作用。为了改善其药代动力学效果,将其与HSA融合来延长其半衰期,此抑制剂被命名为PAItrap2-HSA。采用化学发光实验,证明了 PAItrap2-HSA对PAI-1的抑制能力和特异性(IC50=260nM)。在体外实验中,PAItrap2-HSA显著性提高了血栓溶解能力通过抑制内源性或者外源性PAI-1。在小鼠实验中,PAItrap2-HSA能够有效的抑制血栓的形成和血小板的聚集。在小鼠炎症模型中,我们观察到PAItrap2-HSA作为一个特异性的PAI-1抑制剂能够显著性降低血浆中炎症因子和PAI-1的含量,提高了小鼠的生存率。同时,也没有观察到PAItrap2-HSA引起小鼠的出血风险。这些实验结果表明,PAItrap2-HSA能够通过调节PAI-1的活性和PAI-1的含量,为治疗血栓性疾病和炎症提供了一种新的治疗思路。
【图文】：

ｃｅｎｔｒｅ邋ｌｏｏｐ，邋ＲＣＬ）组成。ＰＡＩ－１存在三种不同构象：激活态、潜伏态（ｌａｔｅｎｔ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ自发插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔ邋Ａ中导致其活性丧失）以及剪切态（ｃｌｅａｖｅｄ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ被ＰＡ切段并插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔＡ中）（如图１－１）邋［１２］。其中ＲＣＬ是ＰＡＩ－逡逑１发挥抑制活性的主要部位，它能插入到其靶酶纤溶酶原激活物（ＰＡ）的催化中逡逑心并与其共价结合，导致靶酶催化中心构象变形而失活。ＰＡＩ－１对ｔＰＡ或者ｕＰＡ逡逑的抑制非常的快，其抑制二级速率常数是而对于凝血酶，纤溶酶，激逡逑活蛋白Ｃ具有非常低的亲和力（ｌ0Ｍ0４邋Ｍ＇Ｖ１）逡逑ｉｆｆ逡逑Ａ？激活态（ＰＤＢ邋１ＤＶＭ）邋Ｂ．潜伏态（ＰＤＢ邋１ＤＶＮ）邋Ｃ．剪切态｛ＰＤＢ邋３ＣＶＭ｝逡逑图１－１．邋ＰＡＩ－１的三种构象。０－ｓｈｅｅｔＡ标记为红色，ＲＣＬ为黄色。逡逑另外，我们课题组在２０１１年和２０１５年测定了邋ｕＰＡ＿ＰＡＩ－ｌ米氏复合物和逡逑ｔＰＡ．ＰＡＩ－１米氏复合物三维晶体结构（如图１－２）［１６，，１７］。阐明了邋ＰＡＩ－１与纤溶酶原激逡逑活物的相互作用的机理。逡逑２逡逑

ｃｅｎｔｒｅ邋ｌｏｏｐ，邋ＲＣＬ）组成。ＰＡＩ－１存在三种不同构象：激活态、潜伏态（ｌａｔｅｎｔ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ自发插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔ邋Ａ中导致其活性丧失）以及剪切态（ｃｌｅａｖｅｄ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ被ＰＡ切段并插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔＡ中）（如图１－１）邋［１２］。其中ＲＣＬ是ＰＡＩ－逡逑１发挥抑制活性的主要部位，它能插入到其靶酶纤溶酶原激活物（ＰＡ）的催化中逡逑心并与其共价结合，导致靶酶催化中心构象变形而失活。ＰＡＩ－１对ｔＰＡ或者ｕＰＡ逡逑的抑制非常的快，其抑制二级速率常数是而对于凝血酶，纤溶酶，激逡逑活蛋白Ｃ具有非常低的亲和力（ｌ0Ｍ0４邋Ｍ＇Ｖ１）逡逑ｉｆｆ逡逑Ａ？激活态（ＰＤＢ邋１ＤＶＭ）邋Ｂ．潜伏态（ＰＤＢ邋１ＤＶＮ）邋Ｃ．剪切态｛ＰＤＢ邋３ＣＶＭ｝逡逑图１－１．邋ＰＡＩ－１的三种构象。０－ｓｈｅｅｔＡ标记为红色，ＲＣＬ为黄色。逡逑另外，我们课题组在２０１１年和２０１５年测定了邋ｕＰＡ＿ＰＡＩ－ｌ米氏复合物和逡逑ｔＰＡ．ＰＡＩ－１米氏复合物三维晶体结构（如图１－２）［１６，１７］。阐明了邋ＰＡＩ－１与纤溶酶原激逡逑活物的相互作用的机理。逡逑２逡逑
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914;R966

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘丹丹;刘思国;陈建泉;许小琴;成国祥;;人血清白蛋白及其重组表达研究进展[J];生物技术通讯;2016年04期

2 王怡;;稻米生产人血清白蛋白技术[J];技术与市场;2010年06期

3 满初日嘎;张英霞;张云;;重组人血清白蛋白的研究进展[J];生物医学工程学杂志;2009年04期

4 ;我国成功研制稻米生产人血清白蛋白技术[J];广东农业科学;2009年12期

5 彭晖,余学清,娄探奇,方芳,周飞宇,尹培达;人血清白蛋白对近端肾小管上皮细胞骨调素和CD44表达的影响[J];中国病理生理杂志;2005年05期

6 黄明志,郭美锦,储炬,杭海峰,庄英萍,张嗣良;重组人血清白蛋白发酵过程表达期的定量研究[J];生物工程学报;2003年01期

7 刘永东,王云山,苏志国;重组人血清白蛋白生产工艺研究进展[J];微生物学通报;2003年05期

8 郑新民,乔宪凤,杨在清,魏庆信;转人血清白蛋白基因猪的表达分析[J];经济动物学报;2002年02期

9 郑新民,华文君,肖作焕;转人血清白蛋白基因猪的整合与表达[J];湖北农业科学;2002年05期

10 姚树林,田嘉禾;~(99)Tc~m-人血清白蛋白扫描在小儿蛋白质丢失性肠病中的运用[J];国外医学(放射医学核医学分册);2000年05期

相关会议论文 前10条

1 杨峰;卞传兵;朱丽丽;赵更香;陈锦灿;叶小明;黄子祥;陈明晃;黄明东;;人血清白蛋白酯酶活性的结构证据及其在药物设计的应用[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年

2 郑晓宇;何婷婷;孙洋洋;陈丹丹;杜传荣;;一种咖啡酸衍生物的制备及其与人血清白蛋白相互作用研究[A];中国化学会第十七届全国有机分析与生物分析学术研讨会论文集[C];2013年

3 程小丽;黄强;李生海;郭思明;甘义磊;何丽君;;苦杏仁苷与人血清白蛋白的荧光光谱研究[A];甘肃省化学会第二十八届年会暨第十届中学化学教学经验交流会论文集[C];2013年

4 黄臻臻;王皓南;杨文胜;;基于金纳米簇荧光增强效应的人血清白蛋白检测方法[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第三分会：纳米传感新原理新方法[C];2016年

5 何洋;宁婷婷;谢婷婷;仇晴川;张莉平;安娜;杨代常;;水稻胚乳细胞高效表达重组人血清白蛋白及产业化[A];中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编[C];2009年

6 韩晓乐;李冉;李佳涵;刘义;;光谱法研究二氯喹啉酸与人血清白蛋白的相互作用[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

7 彭晖;余学清;尹培达;娄探奇;方芳;周飞宇;;人血清白蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞表达骨调素和CD44[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年

8 王丹丹;乔晓娜;樊丽;双少敏;;头孢类抗生素与人血清白蛋白相互作用的光谱学研究[A];第十届中国化学会分析化学年会暨第十届全国原子光谱学术会议论文摘要集[C];2009年

9 许小青;蔡称心;;5-氟尿嘧啶与人血清白蛋白作用的机理研究[A];第十四届全国有机电化学与工业学术会议暨中国化工学会精细化工专业委员会全国第182次学术会议会议论文摘要[C];2014年

10 王小茹;谢晓芸;张雅珩;杨颖;陈兴国;;利用分子模拟及光谱技术研究香兰素与人血清白蛋白的相互作用[A];第十届中国化学会分析化学年会暨第十届全国原子光谱学术会议论文摘要集[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 李蕴明;杨代常：种出“人血清白蛋白”不是科幻[N];医药经济报;2018年

2 本报驻鄂记者 钱忠军 通讯员 朱明霞 吴江龙;用稻米“造血”，这不是天方夜谭[N];文汇报;2017年

3 记者 李墨 通讯员 朱明霞;10年冷板凳炼就“黄金救命药”[N];湖北日报;2017年

4 ;水稻种出人血清白蛋白？[N];北京日报;2011年

5 王怀民 赵凤华;我国科学家从水稻中提取人血清白蛋白[N];粮油市场报;2009年

6 记者 戴劲松;我科学家利用稻米,生产出人血清白蛋白[N];新华每日电讯;2009年

7 实习记者 胡珉琦;杨代常：水稻产出人血清[N];北京科技报;2009年

8 戴劲松;武汉大学从稻米中成功提取生产人血清白蛋白[N];中国技术市场报;2009年

9 新文;人血清白蛋白有望从猪体中提取[N];医药经济报;2002年

10 记者 王春;基因重组人血清白蛋白项目迈向产业化[N];科技日报;2012年

相关博士学位论文 前10条

1 周喜敏;某些有机小分子与人血清白蛋白的相互作用研究[D];兰州大学;2012年

2 林爱华;阿霉素与人血清白蛋白和心肌肌球蛋白的相互作用[D];武汉大学;2005年

3 唐江宏;有机小分子与人血清白蛋白的相互作用研究[D];兰州大学;2006年

4 白国允;药物与蛋白质弱相互作用的NMR研究[D];中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）;2005年

5 李颖;中药有效成分与人血清白蛋白相互作用研究[D];兰州大学;2007年

6 陈镇;植物源重组人血清白蛋白的残留宿主杂质研究[D];武汉大学;2014年

7 林朝阳;构建可选择性杀灭转基因水稻并利用该体系表达人血清白蛋白[D];浙江大学;2008年

8 岳园园;某些染料、药物小分子与蛋白质的相互作用研究[D];兰州大学;2010年

9 周喜敏;某些有机小分子与人血清白蛋白的相互作用研究[D];兰州大学;2012年

10 张青;葡聚糖内切酶在转基因水稻种子中的表达及水稻种子中重组人血清白蛋白的纯化[D];浙江大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 彭双周;长效性PAI-1抑制剂的设计及分子药理活性研究[D];福建农林大学;2018年

2 胡延喜;赤芍总苷在大鼠体内药代动力学和芍药苷与人血清白蛋白相互作用研究[D];辽宁大学;2018年

3 苑立霞;儿茶素—嘧啶类抗癌药物协同体系与蛋白质相互作用的热力学研究[D];聊城大学;2018年

4 李辰雨;毕赤氏酵母发酵液中重组人血清白蛋白分离纯化工艺的初步研究[D];烟台大学;2016年

5 刘彦丽;巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的研究[D];北京化工大学;2003年

6 孙战胜;重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达[D];北京化工大学;2004年

7 李华岑;喹诺酮类药物和人血清白蛋白的光谱分析研究[D];郑州大学;2004年

8 曹慧明;多氯联苯类化合物与人血清白蛋白的相互作用研究[D];兰州大学;2012年

9 郭丽;尼泊金酯类防腐剂与人血清白蛋白的相互作用研究[D];兰州大学;2009年

10 刘晓娟;多酚与人血清白蛋白相互作用研究[D];上海师范大学;2017年

本文编号：2619545