阿司匹林抑制破骨细胞生成的分子机制研究

发布时间：2017-03-22 20:13

  本文关键词：阿司匹林抑制破骨细胞生成的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:破骨细胞与成骨细胞体内的动态平衡,是维持骨的体内平衡的最关键因素,它是由单核细胞/巨噬细胞相互融合而成并发挥其骨吸收功能。RANKL,是肿瘤坏死因子的家族的一员,也是关键的破骨细胞分化因子,它通过与细胞表面RANK的结合,刺激激活胞浆内肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)表达,进而激活相应的下游信号因子如P38,C-JNK,ERK,NF-κB。通过这种复杂的激活反应,最后破骨前体细胞相互融合成为成熟的多核破骨细胞,发挥破骨功能,并表达标志性的蛋白如TRAP,CTSK,CTR,MMP-9等。骨质疏松症被认为是一种代谢性疾病,其特征是骨量的减少和骨折风险的增加,是老龄化社会一个主要的公共健康问题。几种抗骨质疏松药物如双膦酸盐类、降钙素及雌激素等已被广泛运用于临床,但是,它们都具有其临床疗效的局限性和副作用。阿司匹林是一种常见廉价安全的药物,它通常被用作有效的解热、镇痛和抗炎药。近年也发现其有抗血栓、抗大肠癌等功效。然而,它似乎还有更多的功效有待被发现。根据流行病学调查和本课题组进行的初步研究,证明了阿司匹林对去势大鼠模型的骨密度有促进作用,这意味着阿司匹林具有防治绝经后骨质疏松症的潜在临床价值。但阿司匹林如何起到抗骨质疏松作用的分子机制尚未清楚。目的:研究不同浓度阿司匹林对RANKL诱导的RAW264.7细胞系中破骨细胞的生成分化和活性影响,以及其对破骨细胞中NF-κB通道和MAPKs通道系列信号分子表达及其磷酸化活性的影响,探讨阿司匹林对破骨细胞影响的分子机制,从而为阿司匹林创新应用于防治绝经后骨质疏松症提供全新的理论依据。方法:RAW264.7细胞系进行常规传代培养,当细胞生长融合达80%时即可用于实验。②实验分为6组:A组阴性对照组,即常规培养液中不含阿司匹林及RANKL;B组阳性对照组,即常规培养液中加入100ng/ml RANKL;C-F组为添加不同浓度的阿司匹林实验组(C组0.25m M、D组0.5m M、E组1.0m M、F组1.5m M),且均含100ng/ml RANKL。③将104每孔的处于对数期RAW264.7细胞接种于96孔板中,与不同浓度阿司匹林组共培养24h,进行常规MTT检测活细胞的相对数量。④将2×105每孔对数期RAW264.7细胞接种于24孔板的爬片上,常规培养18h后,加入各组培养液诱导培养5天,对各组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色,把含有3个或者3个以上细胞核的TRAP阳性细胞认为是破骨细胞。在光学显微镜下任意选取3个区域,观察爬片上破骨细胞,并计数。⑤将2×105对数期RAW264.7细胞接种于6孔板上,常规培养18h后,加入各组培养液诱导培养5天,通过Real Time PCR技术检测破骨细胞标志物基因TRAP,CTSK,MMP-9,CTR的m RNA表达水平。⑥将2×105对数期RAW264.7细胞接种于6孔板上,常规培养18h后,加入各组培养液诱导培养2h,通过Western blot法检测破骨细胞中NF-κB通道三个关键信号分子蛋白IκB-α、p50、p65及其磷酸化分子p-IκB-α、p-p50、p-p65的蛋白表达水平,同时检测MAPKs通道三个信号分子蛋白ERK、p38、JNK及其磷酸化分子p-ERK、p-P38、p-JNK的蛋白表达水平。⑦将2×105对数期RAW264.7细胞接种于6孔板爬片上,常规培养18h后,加入各组培养液诱导培养2h,通过免疫荧光的方法检测爬片上细胞中NF-κB p65的核易位。结果:1)在本研究培养所用阿司匹林浓度范围内,即0.25m M、0.5m M、1.0m M及1.5m M,各培养组细胞未见明显细胞变性或死亡现象,MTT结果显示各组吸光值基本一致,阿司匹林没有表现出对RAW264.7细胞的任何的细胞毒性。2)B、C、D、E、F实验组中在RANKL诱导后均可见体积较大含大量酒红色嗜酸性颗粒的多核细胞即破骨细胞形成,但随着加入干预的阿司匹林浓度的升高,其破骨细胞形成数量逐步减少,且呈剂量依赖形式。3)破骨细胞标志物TRAP,CTSK,MMP-9及CTR的m RNA表达量在RANKL诱导后均有很大的上调,但阿司匹林干预后其标志物的表达有所减少,并随着阿司匹林浓度的增加其标志物的表达量逐步减少,呈剂量依赖形式。4)在RANKL诱导的RAW264.7细胞中,阿司匹林明显抑制IκB α的降解以及其磷酸化。此外,阿司匹林也同时可以显著降低p50、p65的磷酸化,而其非磷酸化的蛋白表达水平无明显变化。5)对于MAPKs通路分子,阿司匹林在RANKL诱导的RAW264.7细胞中对非磷酸化的ERK,p38和JNK的蛋白表达量影响不大,但阿司匹林能显著抑制磷酸化的p-ERK,p-P38和p-JNK的表达。6)与未经RANKL处理的细胞相比,RANKL诱导的RAW264.7细胞中P65从胞质易位到细胞核中明显,而1m M阿司匹林干预后,进入细胞核的NF-κB P65明显减小。结论:阿司匹林可以抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞的破骨细胞生成。这可能与阿司匹林抑制NF-κB信号通路分子(P65、P50、IκB α)和MAPKs(P38、C-JNK和ERK)信号通道分子的磷酸化激活有关,且这种抑制作用在一定范围内和阿司匹林浓度呈正相关。阿司匹林也同时可以抑制NF-κB P65的核易位从而抑制NF-κB活性。这些研究结果预示了阿司匹林是一个潜在的预防和治疗骨质疏松的有效药物。
【关键词】：阿司匹林 破骨细胞 NF-κB MAPKs 骨质疏松
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-26
• 实验一 阿司匹林对RAW264.7 破骨细胞生成及其标志物基因表达的影响26-44
• 1 实验材料26-27
• 1.1 实验用细胞株26
• 1.2 实验试剂26-27
• 1.3 实验设备27
• 2 实验方法27-36
• 2.1 RAW264.7 细胞系的培养传代及冻存27-30
• 2.2 MTT法来检测阿司匹林对RAW264.7 细胞的毒性30-32
• 2.3 TRAP染色32-34
• 2.4 荧光实时定量RT-PCR技术34-36
• 2.5 统计分析36
• 3 实验结果36-42
• 3.1 阿司匹林对破骨细胞生成的影响36-39
• 3.2 阿司匹林对破骨细胞标志物基因表达的影响39-42
• 4 讨论42-44
• 实验二 阿司匹林对破骨细胞系中NF-κB和MAPKs信号通道的影响44-56
• 1 实验材料44-45
• 1.1 实验用细胞株44
• 1.2 实验试剂44-45
• 1.3 实验设备45
• 2 实验方法45-53
• 2.1 RAW264.7 细胞的培养45-46
• 2.2 Western Blot技术46-53
• 3 实验结果53-55
• 3.1 阿司匹林对NF-κB活化的影响53
• 3.2 阿司匹林对MAPKs的影响53-55
• 4 讨论55-56
• 实验三 阿司匹林对破骨细胞系中P65核易位的影响56-61
• 1 实验材料56-57
• 1.1 实验用细胞株56
• 1.2 实验试剂56
• 1.3 实验设备56-57
• 2 实验方法57-58
• 2.1 实验分3组，分组如下57
• 2.2 基本原理57
• 2.3 RAW264.7 细胞的培养57-58
• 2.4 免疫荧光细胞化学染色步骤58
• 3 实验结果58-59
• 4 讨论59-61
• 小结61-62
• 参考文献62-70
• 个人简历和研究成果70-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王建超;颉强;桑宏勋;陈志文;王军;秦国良;马义善;;阿司匹林对去势大鼠腰椎骨密度及微观结构的影响[J];现代生物医学进展;2012年12期

  本文关键词：阿司匹林抑制破骨细胞生成的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：262149