【摘要】：目的:研究和比较衍生自大肠杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)信号肽的多肽P-KKK在体外对标准细菌株及临床分离耐药菌株的杀菌活性,为研发新型抗菌药物提供重要信息。方法:(1)衍生肽的设计:依据大肠杆菌OmpA信号肽(P-AQA)的一级结构MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(蛋氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-结氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-苏氨酸-结氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸)以及功能特点,以其一级结构为模板,在不改变其前部基本结构的前提下,仅将其C末端的5个氨基酸进行替换,设计衍生肽(P-KKK):MKKTAIAIAVALAGFARRKKK(蛋氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-结氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸)。(2)试验第一部分:衍生肽P-KKK对标准菌株杀菌活性测定:运用琼脂铺板计数法,将不同浓度的衍生肽P-KKK分别与几种细菌标准株(3种G~+菌:金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌;3种G~-菌:大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌)在孵育体系中混匀后,置于37℃恒温水浴箱孵育2小时,琼脂铺板后置于37℃恒温培养18~24h。然后记录每一琼脂板上菌落形成数量(CFU),并计算衍生多肽P-KKK作用后的杀菌率。(3)试验第二部分:衍生肽P-KKK对耐药菌株杀菌活性测定:运用琼脂铺板计数法,将不同浓度的衍生肽P-KKK分别与几种耐药菌株:(2种G~+菌耐药菌株:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、高水平庆大霉素耐药(HLGR)屎肠球菌;2种G~—菌耐药菌株:产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌、产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯杆菌)在孵育体系中混匀后,置于37℃恒温水浴箱孵育2小时,琼脂铺板后置于37℃恒温培养18~24h。然后记录每一琼脂板上菌落形成数量(CFU),并计算衍生多肽P-KKK作用后的杀菌率。结果:(1)衍生肽P-KKK对三种G~+菌标准株有较强的杀菌活性,其中对枯草芽孢杆菌杀菌活性最强,对金黄色葡萄球菌及屎肠球菌杀菌活性无明显差别。浓度在200ug/mL时,能杀灭全部的G~+菌,在40ug/mL杀菌率也达92.4%。对三种G~—菌标准株也有较强的杀菌活性,其中对肺炎克雷伯杆菌杀菌活性最强,对大肠杆菌及绿脓杆菌杀菌活性无明显差别。浓度在200ug/mL时,能杀灭96.5%的G~—菌,在40ug/mL杀菌率也在20%-96.4%范围内。(2)衍生多肽P-KKK对2种临床分离G~+菌耐药株具有较强的杀菌活性,浓度在40ug/mL时,能杀灭99.7%的MRSA金黄色葡萄球菌,及99.9%的HLGR屎肠球菌。对2种临床分离G~—菌耐药菌株也具有较强的杀菌活性,当肽分子P-KKK浓度达200ug/mL时,能杀灭99.9%的ESBL大肠杆菌及ESBL肺炎克雷伯杆菌。浓度在40ug/mL时,对ESBL大肠杆菌的杀菌活性为17.3%,对ESBL肺炎克雷伯杆菌的杀菌活性为61.3%。(3)衍生多肽P-KKK对常见细菌标准株及临床分离的耐药菌株杀菌活性无明显差异,而抗生素对标准菌株的杀菌活性比对耐药菌株杀菌活性强100倍左右。结论:(1)大肠杆菌OmpA信号肽衍生多肽P-KKK对常见的G~+菌及G~—菌标准株均具有明显的杀菌活性。对G~+菌的杀菌活性稍强于G~—菌的杀菌活性。对G~+菌中的枯草芽孢杆菌杀菌活性最强,对G~—菌的肺炎克雷伯杆菌活性最强。(2)枯草芽孢杆菌对衍生肽P-KKK分子及课题组前期研究的M17及C26等抗菌肽分子的敏感性明显强于其他类型G~+菌,与枯草芽孢杆菌的某些结构更容易受到肽分子攻击有关。(3)大肠杆菌OmpA信号肽衍生多肽P-KKK对临床分离耐药菌株也具有较强杀菌活性,与对标准菌株杀菌活性无明显差异。而抗生素对标准菌株及临床分离的耐药菌株杀菌活性差异明显,抗生素对标准菌株的杀菌活性比对耐药菌株杀菌活性强约100倍。提示衍生肽P-KKK具有广谱的杀菌活性和独特的杀菌机制,进一步对衍生多肽P-KKK进行结构和功能的研究,将可能有助于研发出对耐药菌株敏感同时又不易产生耐药性的新型抗菌药物。
【图文】：
16图 2-1 衍生肽 P-KKK 分子 HPLC 分析报告图Figure 2-1 HPLC analysis report of peptide P-KKK.1.3 大肠杆菌 OmpA 信号肽衍生肽 P-KKK 的保存使用前将衍生肽冻干粉（4mg）离心，使其全部沉于试管底部，溶解于
金黄色葡萄球菌经革兰染色后在油镜下所观察到的形态
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
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