托伐普坦对大鼠脑出血后脑水肿治疗机制及铁离子对神经细胞的活力的影响研究

发布时间：2020-04-25 02:04

【摘要】：脑出血在临床上属于常见病、多发病,它是指由多种原因导致脑血管破裂而引起的脑实质出血,据统计,脑卒中是全球中老年人死亡和致残的主要原因之一,已经上升为世界第二大死亡原因,每年大约有1 600万人首次脑卒中发生,导致近600万人死亡,其中脑出血占全部脑卒中的10%~30%[1]。虽然脑出血的发病率低于脑梗死,但病死率却远远高于后者。随着医学技术的进步,脑出血病死率虽然有所降低,但在急性期的死亡率仍可高达30%~40%,且幸存者中仅12%~39%的患者未遗留残疾,而大部分患者留下的后遗症也使得其基本丧失劳动能力,给患者的家庭造成了沉重负担。尽管针对脑出血的研究从未驻足,但迄今为止其发生发展机制仍未明确,可供临床选择治疗脑出血的方法亦较少,仍无具体药物或手术方法治疗可显著改善患者的预后。因此,进一步深入研究脑出血的发生发展机制及防治手段,探索脑出血的治疗新靶点,具有重要意义。在这项研究中,我们探讨了V2受体拮抗剂托伐普坦对大鼠脑出血后脑水肿的作用及铁离子对神经细胞的影响。在ICH手术后12小时、36小时和60小时,通过口服强饲法将动物随机给予托伐普坦或生理盐水。本研究采用了测量脑肿胀(%)、脑含水量(BWC)、神经学评分、伊文思蓝荧光和血脑屏障(BBB)紧密连接蛋白,来判断托伐普坦在ICH后的效果。我们发现托伐普坦减轻了脑肿胀(%),减少了脑水含量在脑出血后的增加,减轻了ICH后的神经功能缺损。更重要的是,托伐普坦组ZO-1和occludin的表达上调,同时可以使MMP-9表达下调,结果表明托伐普坦在大鼠脑出血后对BBB具有一定保护作用。同时体外用单一因素铁离子模拟脑出血的实验说明了铁离子在低浓度时对神经细胞影响不大,但在一定浓度之后会产生细胞毒性作用。实验结果为托伐普坦用于治疗ICH诱发的脑水肿提供了有力的数据支持。同时有必要用更加接近人体结构的动物的实验数据,来进一步研究托伐普坦在ICH手术后的治疗中的功效及机制。一、托伐普坦在大鼠脑出血后脑水肿治疗中的作用研究目的以SD大鼠胶原酶脑出血ICH模型为基础,造模后12小时,分为托伐普坦组和生理盐水组口饲给药,每隔24小时对大鼠给一次药,并测量大鼠3天后的体重、BBB通透性、脑水含量(brain water content,BWC)和行为学,观察药物托伐普坦对实验用大鼠在ICH后脑水肿消肿的影响。方法ICH手术前将40只大鼠随机的划分成2组:ICH组和sham组,ICH组32只大鼠,假手术sham组5只,其他备用。ICH组采用基底节区注射胶原酶的方法进行ICH组的造模,假手术组组对实验动物只进针而不注射胶原酶,在术后12小时后,每24小时灌胃一次,共灌胃三次,ICH组中随机抽取16只作为给药组,按每kg大鼠给予10mg托伐普坦(Tolvaptan)的剂量,将药片直接溶于饮用水中进行口饲灌胃;剩下16只作为对照组,对照组和sham组同时口饲等体积的水。在术后的第四天,对所有实验用的动物进行转角角度测试实验和前肢放置测试以进行行为学测试评分,然后进行MRI核磁共振扫描来测量脑水肿体积和程度。在MRI测量完成后,在给药组和对照组中随机选取8只,sham组选取两只,麻醉脱颈处死取脑测量其脑水含量BWC以测估其脑部水肿的程度,并且对剩下的6只和sham组的3只进行伊文斯蓝(evans blue,EB)渗出实验来检测实验动物的BBB通透性。结果1.磁共振成像结果表明,通过口饲托伐普坦的实验大鼠的脑水肿体积得到了减小(p0.05)。并且BWC结果表明,注射托伐普坦的大鼠对比对照组大鼠,脑水含量得到减少,减轻了脑水肿。2.虽然m NSS评分测试数据和前肢放置测试数据显示托伐普坦对于大鼠神经功能的改善效果并未达到统计学上的差异(p0.05),但是单从转角实验测试数据我们可以得出托伐普坦有助于恢复大鼠在ICH后的一部分神经功能(p0.05)。3.从EB免疫荧光和EB外渗定量的结果中来看,托伐普坦有效减少了EB染料血管外的渗出,间接表明在保持大鼠ICH后BBB完整性上托伐普坦起到了积极作用。结论口饲给予托伐普坦可有效缩小脑出血后脑水肿的体积,对脑出血后的血脑屏障具有一定的保护作用。二、托伐普坦对大鼠脑出血后血脑屏障的保护机制研究目的建立大鼠ICH模型,口饲给药后,通过检测BBB相关紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)以及细胞基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases)中MMP-9的表达情况,研究分析托伐普坦对BBB的保护效果和内在机理。方法ICH手术前将25只大鼠随机的划分成2组:ICH组和sham组,ICH组20只大鼠,假手术sham组4只,其他备用。ICH组的造模过程与上一章节保持一致,在术后12小时后,ICH组中随机抽取10只作为给药组,剩下10只作为对照组,给药剂量和给药次数与上一章节保持一致,对照组和sham组同时口饲等体积的水。在术后的第三天,ICH给药组和ICH实验组每组随机选择5只实验动物进行免疫荧光染色检测BBB相关连的紧密蛋白(ZO-1,occludin)的表达,另外再每组取5只,采用蛋白质印迹(western blot,WB)法对ZO-1、occludin、MMP-9三种蛋白进行定量比较。结果1.通过免疫荧光,WB两种手段对血肿周围的ZO-1、occludin表达检测,发现托伐普坦可上调这两种BBB相关紧密连接蛋白表达,实验结果表明托伐普坦对于维持BBB完整性具有积极作用。2.免疫荧光及WB实验结果说明,给药组大鼠ICH后MMP-9表达的减少,说明了托伐普坦对BBB具有一定的保护作用。结论尽管大鼠ICH后口饲给予V2受体拮抗剂托伐普坦对于脑水肿减轻的作用机制的研究并没有非常深入,但从整体效应上来看,托伐普坦对BBB起到了一定的保护效果。三、铁离子模拟脑出血对神经细胞的影响浅究目的以大鼠肾上腺鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞作为神经元的的体外模型细胞,培养基中给予一定浓度的铁离子后,48h后检测cck8的吸光度,以检测在一定的药物浓度梯度下PC12的增殖情况,同时用流式细胞仪检测其凋亡情况,以探究铁离子对神经细胞造成损伤的浓度大致范围。方法设置硫酸亚铁浓度为1000μM组、800μM组、400μM组、200μM组、100μM组、80μM组、50μM组、20μM组、10μM组、5μM组,control组和空白组,待细胞加药培养48h后,加入CCK8检测试剂(10μL/孔),用多功能酶标仪在波长450nm处测定光密度值[D(450)],同时挑取1000μM组、800μM组、400μM组、200μM组、100μM组、80μM组,同样处理48h后,用凋亡试剂盒进行Annexin V与PI双染,用流式细胞仪在488nm通道下检测两种染料的荧光信号强度,以区分凋亡和坏死细胞。结果在低浓度下铁离子对PC12的作用不太明显,在200umol/L的浓度下即开始凋亡,在800umol/L的浓度下即可看到肉眼可见的死亡。结论铁离子在低浓度时对神经细胞作用不大,但在大于一定浓度之后会产生细胞毒性作用,造成神经细胞的凋亡和坏死。
【图文】：

统计图,脑水含量,统计图,脑水肿

西南大学硕士学位论文4 研究结果与分析4.1 托伐普坦在大鼠脑出血后脑水肿治疗中的作用4.1.1 托伐普坦对大鼠 ICH 后对脑水肿的作用术后第三天，磁共振图像分析（图 1A，B）发现，给药组有效减小了水肿体积(tolvaptan vs vehicle p < 0.05)。同时，脑水含量的测量显示（图 1C），托伐普坦可减轻患侧半球脑水含量(tolvaptan vs vehicle ，p < 0.05)，，而非患侧半球脑水含量实验组组与对照组间无统计学差异(tolvaptan vs vehicle，p > 0.05)

行为学,完整性

图 2 行为学结果4.1.3 伊文斯蓝(Evans blue, EB)渗出实验结果如图 3 示，术后第 3 天，EB 荧光法观察血脑屏障完整性实验和 EB 外渗定量法测量 BBB 完整性实验都提示给药组有效减小了 EB 染料血管外渗出(p < 0.05)。提示托伐普坦在大鼠 ICH 后保护 BBB 完整性上有积极作用。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

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