【摘要】：中空介孔二氧化钛(TiO_2)作为声敏剂在超声下可产生活性氧(ROS)而具有声动力学治疗(SDT)的作用。但该纳米粒在肿瘤部位蓄积量较少,且其所介导的声疗效果受肿瘤深部乏氧环境的限制。为解决该问题,本课题构建了基于血红蛋白(Hb)联合声疗和化疗的仿生递药系统(CCM-Hb-TiO_2/RRx-001)。该体系具有以下特点:1)纳米粒在MCF-7人乳腺癌细胞来源细胞膜(CCM)的伪装下,在血循环中免疫逃逸后同源靶向到肿瘤组织。2)Hb在乏氧的肿瘤组织释放氧气,增敏TiO_2的SDT效果。3)RRx-001一方面增强脱氧Hb(Deoxy-Hb)的亚硝酸盐还原酶活性,将肿瘤部位亚硝酸盐(NO_2~㧟)还原为一氧化氮(NO),具有一定的扩血管和抗肿瘤效果;另一方面还可消耗肿瘤细胞内的谷胱甘肽(GSH),进而提高ROS水平,协同SDT。因此,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001可基于Hb联合SDT和化疗,协同增加胞内活性氧和活性氮物质(RONS),促进细胞凋亡、DNA断裂,增强抗瘤活性。主要研究内容如下:1.首先,以合成二氧化硅为模板,通过溶胶凝胶法和煅烧、刻蚀等过程制备中空介孔TiO_2纳米粒。然后用3-氨丙基三乙氧基硅烷使TiO_2表面氨基功能化,再经酰胺化反应共价修饰Hb。随后以超声分散法负载抗癌新药RRx-001,最后与MCF-7细胞经低渗裂解、匀浆、差速离心而得的CCM共挤压,得到CCM-Hb-TiO_2/RRx-001。通过透射电镜、傅里叶红外光谱、紫外可见光谱等证实了CCM-Hb-TiO_2/RRx-001的成功制备,纳米粒度分析仪测得最终粒径为145.6±3.6 nm,电位为㧟21.7±1.0 mV。氧气释放实验中,以三(4,7-二苯基-1,10-邻菲Up啉)二氯化钌(Ru(dpp)_3Cl_2)为氧气指示剂,测得CCM-Hb-TiO_2/RRx-001的氧气释放量是游离Hb的2.5倍左右。以SOSG为ROS检测探针,CCM-Hb-TiO_2比CCM-TiO_2能产生更多的ROS,且具有超声时间依赖性。此外,GSH含量测定结果也显示,随RRx-001浓度依赖性的降低。2.体外实验中,通过将红色荧光染料尼罗红(NR)负载到制剂中,以Hb-TiO_2/NR为对照,考察6种不同来源细胞(MCF-7、MDA-MB-231、Hs538Bst、HepG2、NIH 3T3、RAW 264.7)对MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/NR的摄取情况,证实了该纳米系统的同源靶向性(MCF-7细胞中增强的红色荧光)和免疫逃逸特性(RAW 264.7细胞中减弱的红色荧光)。选用MCF-7细胞为考察对象,分别以DHE和DAF-FM DA为ROS和NO检测探针,通过荧光定性和流式定量结果表明,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超声下(1 W cm~(-2),1 MHz,30 s)能显著增加细胞中ROS和NO水平。胞内GSH含量的测定结果显示,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超声下可降低胞内GSH水平至40%左右,有利于提高胞内ROS水平。以SRB法评价的细胞毒性实验中,载体CCM-Hb-TiO_2无明显毒性,而制剂组CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超声下导致细胞存活率显著下降(19.0±2.2%)。3.体内实验中,将近红外荧光染料IR783负载到制剂中,以荷MCF-7瘤以及同时荷MCF-7瘤和HepG2瘤的裸鼠为模型,观察尾静脉注射Hb-TiO_2/IR783和CCM-Hb-TiO_2/IR783后在裸鼠体内的分布情况。活体成像结果显示,MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/IR783对体内MCF-7瘤具有同源特异靶向性,可增加制剂在肿瘤部位的蓄积。肿瘤组织的切片结果表明,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001可使肿瘤部位血管扩张,同时增加肿瘤部位的药物分布,并降低HIF-1α的表达。给予超声照射(1 W cm~(-2),1 MHz,30 s)后,可明显增加肿瘤部位的ROS和NO水平。药效实验中,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001组在超声下的相对瘤体积降至1.17±0.10,显著抑制肿瘤生长。同时,HE染色发现明显的肿瘤细胞破碎,TUNEL检测到严重的细胞凋亡,γ-H2AX显示较多的DNA双链断裂。另外,各组小鼠体重、各主要器官组织的HE染色等均无明显异常变化,表明CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在体内具有较好的生物安全性。综上所述,MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/RRx-001,可增加其在MCF-7肿瘤中的积聚,在超声下协同增加RONS,实现基于Hb的声疗和化疗联合,显著增强抗瘤活性;且生物安全性较好,具有很好的临床应用前景。
【图文】：
SDT作用机制[14]
RRx-001的作用机制
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943
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