白介素-1β和肿瘤坏死因子-α对酸敏感离子通道1a介导的关节软骨细胞凋亡的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-30 11:58

【摘要】：类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,导致关节和周围组织的慢性进行性炎症性疾病,最终导致不可逆的关节破坏。急性期促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在RA中呈现出较高水平的表达和多效的生物学效应,并促进RA的发生与进展。关节滑液酸化是RA的一个重要病理特征,且酸化程度与关节的破坏成正相关。大量研究报道胞外酸化处理可以显著地诱导关节软骨细胞凋亡。酸敏感离子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是细胞外H+激活的阳离子通道家族,可被细胞外酸化微环境激活,并在酸诱导的细胞损伤中起关键作用。我们课题组前期研究表明酸敏感离子通道1a(Acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)在佐剂型关节炎(Adjuvant arthritis,AA)模型大鼠关节软骨中高表达且参与调节关节软骨损伤,阻断ASIC1a对AA大鼠关节软骨细胞的保护作用与抑制软骨细胞的凋亡有关。近年来研究证实ASIC1a在酸诱导的关节软骨细胞凋亡中发挥重要的作用。然而,RA关节滑液中大量表达的促炎因子(IL-1β和TNF-α)对ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡的作用及其机制至今尚不清楚。为此,我们将采用体外培养的大鼠关节软骨细胞和体内AA大鼠模型为实验对象,开展下述研究:1.IL-1β和TNF-α对ASIC1a的表达与活性的影响采用免疫荧光双染、Western Blot、实时定量PCR法观察胞外不同浓度和不同时间IL-1β和TNF-α刺激大鼠关节软骨细胞后对ASIC1a的表达影响。采用Fura-3/AM探针与激光共聚焦显微镜检测细胞Ca2+浓度的方法,分析IL-1β和TNF-α对胞外酸化激活的钙离子跨膜流动的影响。通过构建p GL3-ASIC1promoter荧光素酶报告基因质粒,双荧光素酶报告基因(Dual Luciferase)检测促炎因子对ASIC1启动子活性的影响。结果显示,IL-1β和TNF-α可以以浓度依赖性方式上调ASIC1a蛋白与m RNA在关节软骨细胞中的表达,同时也能增加酸诱导的胞内钙离子([Ca2+]i)水平上升。另外,IL-1β和TNF-α预处理后可以显著地增加ASIC1启动子的活性。结果提示AA大鼠关节软骨细胞中ASIC1a高表达与IL-1β和TNF-α有关。2.IL-1β和TNF-α调控ASIC1a表达和活性的具体分子机制采用免疫荧光双染观察AA大鼠关节软骨中ASIC1a与促炎因子下游重要的转录因子NF-κB p65的共定位情况。通过阻断NF-κB和MAPK信号通路相关亚族ERK、p38、JNK、NF-κB p65的磷酸化,来分析NF-κB和MAPK信号通路抑制后对IL-1β和TNF-α上调ASIC1a表达和启动子活性的影响。结果显示ASIC1a与NF-κB p65在AA大鼠关节软骨组织中呈明显的高表达和共定位的现象;IL-1β和TNF-α可以激活NF-κB和MAPK信号通路,且抑制通路激活后可以减弱IL-1β和TNF-α上调的ASIC1a表达和启动子活性。进一步采用EMSA和CHIP实验,来验证转录因子NF-κB p65与ASIC1的启动子中的NF-κB位点结合的情况。结果显示IL-1β和TNF-α均能诱导软骨细胞NF-κB p65招募到ASIC1基因启动子区域,而PDTC(10μM)预处理1 h能显著地减弱这种结合作用。结果提示转录因子NF-κB通过与ASIC1启动子序列中NF-κB位点的结合参与了IL-1β和TNF-α上调大鼠关节软骨细胞ASIC1a表达的过程。3.IL-1β和TNF-α对ASIC1a介导的大鼠软骨细胞凋亡的影响采用MTT、LDH、Hoechst 33258染色和流式细胞术分析促炎因子、钙离子螯合剂BAPTA-AM、ASIC1a特异性阻断剂psalmotoxin-1(Pc TX-1)以及ASIC1a的短发夹RNA(sh RNA)对ASIC1a介导的关节软骨细胞毒性和凋亡的影响;JC-1检测线粒体膜电位和Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。结果显示IL-1β和TNF-α能进一步降低酸抑制的软骨细胞活力,且增加酸诱导的软骨细胞LDH的释放、线粒体膜电位丧失;同时上调cleaved PARP和cleaved Caspase-3/9的表达以及细胞凋亡率。而这种增强作用可以被ASIC1a特异性抑制剂Pc TX-1、ASIC1ash RNA或BAPTA-AM减弱。结果提示IL-1β和TNF-α能够增强ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡。4.ASIC1a激活对IL-1β和TNF-α促进的软骨细胞基质代谢基因表达的影响采用实时定量PCR(q PCR)检查酸化激活的ASIC1a对IL-1β和TNF-α诱导的关节软骨细胞基质代谢相关基因表达的影响。结果显示IL-1β和TNF-α能显著地诱导软骨细胞中MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5 m RNA的表达;而酸化处理(pH 6.0)可以进一步增强促炎因子诱导的MMP-3/13和ADAMTS-5的表达。Pc TX-1预处理可部分地减少酸增强IL-1β诱导的MMP-3/13和ADAMTS-5 m RNA水平。结果提示,酸激活的ASIC1a增强了IL-1β和TNF-α诱导的关节软骨细胞MMP-3/13和ADAMTS-5的表达。综上所述,本研究结果提示IL-1β和TNF-α能以NF-κB依赖性方式促进ASIC1a的表达和活性,进而增强ASIC1a介导的关节软骨细胞凋亡;这也丰富人们对ASIC1a和促炎因子功能的认识,为RA的防治提供新思路。
【图文】：

参考文献,结构示意图,酸化

SF）中表现出一定程度的酸化，并且活动期 RA 患者6.0以下[15-18]。值得注意的是，放射学结果显示出 RA患节的破坏成正相关[16, 19]。近期已有研究报道，关节软影响，这些结果都提示酸化可能参与了 RA 的软骨损研究也发现，胞外酸化可以 pH 依赖性的诱导 AA 大鼠节软骨细胞基质成分Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚糖体的降酸化参与了 RA关节软骨的破坏[20-23]。细胞凋亡-sensing ion channels, ASICs）是属于上皮钠通道（Na+（degenerin, DEG）家族的电压非依赖性阳离子通道，所激活[24]。迄今为止，在哺乳动物中已经鉴定了由 4CN2，ACCN3 和 ACCN4）编码的 7 个 ASIC 蛋白质亚1b2, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3, ASIC4）[25]。这些 ASICs体

体重变化,关节炎,情况,大鼠

结果.1 ASIC1a 和 NF-κB p65 在 AA 大鼠关节软骨中高表达与共定位情况.1.1 AA 模型的建立及其病理学变化情况.1.1.1 CFA 诱导的 AA 大鼠模型大鼠佐剂性关节炎（AA）是多关节炎的实验模型，已被广泛用于疾病发病研究和许多抗关节炎药物的临床前研究[39]。SD 大鼠足爪免疫后第 28 天，，诱重的关节炎。结果显示：造模后第 21 天后，与正常组大鼠比较，AA 模型组继发测足爪有明显地肿胀、明显僵直和畸形，尾部出现 “关节炎”结节（A）；与正常组相比，AA 组大鼠体重增长有显著地抑制现象（图 1B）；与正大鼠比较，AA模型组的关节炎评分（AA score）随着造模时间增加（d14, d228），关节炎评分越高（图 1C），表明 AA 动物模型造模成功。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

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