没食子酸及三种儿茶素酚类对米黑毛霉脂肪酶抑制机理研究

发布时间：2020-05-04 21:26

【摘要】：脂肪酶(lipase E.C.3.1.1.3)也称为三酰基甘油酰基水解酶,几乎普遍存在于生物界中的每一个角落。作为生命体活动的重要代谢酶,所有的脂肪酶都属于丝氨酸水解酶,它们在结构上都具有一个保守的五肽,使得所有脂肪酶虽序列差异大仍能够催化相同反应的发生。脂肪酶抑制剂则是能够抑制脂肪酶活性的物质,因此他们能够使膳食脂肪在分解反应的过程中受到抑制,减少人体对脂肪的吸收,从而控制和治疗肥胖的作用。这是目前治疗肥胖最主要的策略,即开发营养消化吸收抑制剂,如临床唯一批准的治疗肥胖药物奥利司他(Orlista)。然而,长期服用该药物却会引发一系列副作用。因而,寻求低毒、高效的脂肪酶抑制剂成为一大研究热点。本研究中以米黑毛霉脂肪酶(Mucor miehei Lipase,MML)为研究对象,研究其催化长链脂肪酸酰基酯中的对硝基苯酚棕榈酸酯(4-Nitrophenyl palmitate,p-PNC16)水解反应的酶学性质。实验结果表明,MML催化底物p-NPC16水解反应最适温度35 ℃,最适反应pH在7.8-8.2之间,且该酶在pH 8.0-9.0和30-40 ℃范围内具有较高的酶活力。该酶催化底物p-NPC16水解的动力学参数米氏常数Km和最大速度Vm分别为0.59 mmol/L和24.69 μmol/L/min。测定的16种常见金属离子及其酸根离子在一定浓度(1-10 mmol/L)内对该反应的影响,结果表明Li+、Na+、K+、SO42-、Cl-、NO3-对米黑毛霉脂肪酶活力几乎不影响,而Mg2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+在离子浓度达到1.0mmol/L下,分别让酶活力提高 64.2%、51.3%、116.2%和 218.7%。Fe3+、A13+、Zn2+、Hg2+和Cu2+具有抑制酶活力的作用,离子浓度为1.0mmol/L时,分别使酶活力下降了88.5%、82.7%、8.9%、71.2%和 22.9%。此外,本研究还重点研究了没食子酸(G)、表儿茶素(EC)、表没食子酸儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)四种酚类物质对MML的抑制作用。选取的四种酚类物质在结构上具有一定相似性。实验结果表明,四种效应物均具有较为显著的抑制作用。G、EC、EGC和EGCG对应的IC50分别为1.29,0.23,0.026,0.017 mmol/L。G对酶表现出非竞争型抑制,抑制常数为1.29 mmol/L;EC、EGC和EGCG则表现为混合型抑制,其抑制常数依次为,0.146 mmol/L 和 0.375 mmol/L,0.014 mmol/L 和 0.057 mmol/L,0.012 mmol/L 和 0.039 mmol/L。建立在前面的研究基础上,探究四种效应物对MML的失活、抑制作用动力学,建立其抑制模型、测定微观速度常数,其中G对MML的为非竞争型,说明酶与底物、G可逆地独立地结合成无活性的三元复合物。测定的儿茶素类化合物对游离酶的失活速度常数比酶-底物复合物的失活速度常数大,说明底物对MML具有保护作用。四种效应物皆能够和MML相结合,导致酶活性降低。MOE模拟效应物与MML的结合,酶蛋白与小分子配体之间的结合能力由大到小依次是EGCG、EGC、EC和G,它们皆能影响MML活性中心的重要氨基酸残基。荧光淬灭也呈现出一致的结果,即对酶抑制能力最强的EGCG与MML的结合常数(KA)和结合位点(n)高于EGC。综上,本论文一方面以对米黑毛霉脂肪酶催化底物p-PNC16相关酶学性质的研究建立了脂肪酶抑制剂筛选的测活体系,可应用于后续的天然来源的脂肪酶抑制剂和化学合成抑制剂的筛选。另一方面比较研究了四种酚类效应物对米黑毛霉脂肪酶的抑制作用,并探讨了效应物抑制作用与其结构的潜在联系,为脂肪酶抑制剂的筛选和合成提供了理论依据。
【图文】：

胰脂肪酶,脂肪酶

几乎存在于生物界中的每一个角落，比如微生物中的细菌［１８］、霉菌［１９］和动植物逡逑中，如哺乳动物［２（）］、植物［２１］，是生命体活动的重要代谢酶之一［２２］。动物中，，胰逡逑腺脂肪酶在脂肪代谢中具有重要作用（图２）。植物中脂肪酶则是在能量储备组逡逑织中被发现的，而微生物来源的脂肪酶也含量丰富［２３］。同时，脂肪酶也是人们逡逑最早开展相关研究的重要理论研究酶，早在１８３４年，人们就注意到了兔胰腺脂逡逑肪酶的存在。随后近百年来，胃脂肪酶（１９５４年）和植物种子脂肪酶（１８７１年）逡逑也陆续被报道，我国于１９６９年成功研制了脂假丝酵母脂肪酶制剂。其中微生物逡逑脂肪酶的研究从２０世纪初至今更是因其巨大的商业潜能而备受关注。如图３所逡逑示，脂肪酶的研究热度经久不衰，相关研究仍具有非常深远的生理生化以及生逡逑产应用意义［２４］。逡逑８逡逑

脂肪酶,历程,胃脂肪酶,应用意义

肪酶的存在。随后近百年来，胃脂肪酶（１９５４年）和植物种子脂肪酶（１８７１年）逡逑也陆续被报道，我国于１９６９年成功研制了脂假丝酵母脂肪酶制剂。其中微生物逡逑脂肪酶的研究从２０世纪初至今更是因其巨大的商业潜能而备受关注。如图３所逡逑示，脂肪酶的研究热度经久不衰，相关研究仍具有非常深远的生理生化以及生逡逑产应用意义［２４］。逡逑８逡逑
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91

【参考文献】