糖胺聚糖活性适体制备及其应用研究

发布时间：2017-03-24 02:15

  本文关键词：糖胺聚糖活性适体制备及其应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：糖胺聚糖,也称酸性粘多糖,是由重复的二糖单位构成的,其二糖单位之一是氨基己糖。肝素是一种具有抗凝血活性的糖胺聚糖,是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物,其原料主要来源于猪的小肠粘膜,目前,肝素临床用药主要采用注射给药方式,对肝素原料的纯度要求较高,方可保证制剂的用药安全,因此,如何研究绿色环保、成本低廉的肝素纯化新技术成为肝素制剂的关键问题。SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术,是从体外人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得与靶分子特异性亲和的一段寡核苷酸序列。本课题研究通过体外合成一个具有25个随机碱基的寡核苷酸序列库,采用SELEX技术,从中筛选能与肝素特异性亲和作用的核酸序列,将筛选得到的DNA序列进行克隆、测序,通过DNAMAN软件对其一级结构、二级结构进行分析,测定克隆子与肝素的亲和力。实验结果表明,经过25轮筛选,共得到20个克隆子,获得3个高频适配子。软件分析预测其二级结构为茎环状结构,说明茎环结构是适配体与靶分子结合的基础。对3条序列建立酶联免疫吸附试验,检测结果表明,H29与肝素结合的亲和力达到0.528,亲和性较高。肝素特异性适体的获得为今后解决肝素制药难点提供了新思路,新工艺。
【关键词】：肝素 适配子 SELEX ELISA
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-6
• 缩略词一览表6-9
• 第一章 绪论9-18
• 1.1 核酸适配子SELEX筛选研究进展9-14
• 1.1.1 SELEX技术简介9
• 1.1.2 SELEX技术的改良9-10
• 1.1.3 针对不同靶标的适配子的研究10-13
• 1.1.4 SELEX技术的优越性及其应用13-14
• 1.2 肝素的结构和功能14-16
• 1.2.1 结构特征14-15
• 1.2.2 在生物体内的分布及其生理功能15
• 1.2.3 肝素的药理作用15-16
• 1.3 肝素的研究现状及趋势16
• 1.4 研究目的、意义及研究内容16-18
• 1.4.1.研究目的16
• 1.4.2 研究意义16-17
• 1.4.3 研究内容17-18
• 第二章 琼脂糖凝胶作为亲和介质SELEX筛选肝素适配子18-33
• 2.1 引言18
• 2.2 材料与方法18-20
• 2.2.1 质粒与载体18
• 2.2.2 工具酶与主要试剂18-19
• 2.2.3 主要缓冲液与相关试剂及其配制19
• 2.2.4 实验仪器19-20
• 2.3 实验方法20-24
• 2.3.1 初始随机文库的构建及引物的合成20
• 2.3.2 Epoxy-activated SepHrose固定肝素20-21
• 2.3.3 SELEX筛选21
• 2.3.4 PCR扩增21-22
• 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳22
• 2.3.6 次级文库的制备22
• 2.3.7 DNA适配子的克隆测序及分析22-24
• 2.4 结果24-29
• 2.4.1 琼脂糖凝胶鉴定PCR扩增产物24
• 2.4.2 对称PCR扩增反应条件优化结果24-25
• 2.4.3 尿素浓度在PCR扩增反应的优化结果25-26
• 2.4.4 13轮筛选的PCR产物电泳结果26
• 2.4.5 克隆子序列测定结果26-27
• 2.4.6 适配子二级结构分析27-29
• 2.5 讨论29-31
• 2.5.1 文库的选择29-30
• 2.5.2 温度对SELEX筛选的影响30
• 2.5.3 PCR反应条件的优化对SELEX的影响30
• 2.5.4 ssDNA的制备方法30-31
• 2.5.5 适配子的克隆测序31
• 2.5.6 适配子的二级结构分析31
• 2.6 本章小结31-33
• 第三章 以酶标板作为亲和介质SELEX筛选肝素适配子33-38
• 3.1 引言33
• 3.2 材料和方法33-34
• 3.2.1 实验样品33
• 3.2.2 实验试剂与仪器33-34
• 3.2.3 主要溶液的配制34
• 3.2.4 实验方法34
• 3.3 结果与讨论34-36
• 3.3.1 12 轮筛选的 PCR 产物电泳结果34-35
• 3.3.2 克隆子序列测定结果35
• 3.3.3 适配子二级结构预测35-36
• 3.3.4 适配子筛选固相分离介质的选择36
• 3.4 本章小结36-38
• 第四章 克隆适配子的亲和力测定38-43
• 4.1 引言38
• 4.2 材料与方法38-39
• 4.2.1 实验样品38
• 4.2.2 实验试剂38-39
• 4.2.3 主要溶液的配制39
• 4.3 实验方法39-41
• 4.3.1 对称 PCR39
• 4.3.2 不对称PCR39-40
• 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳及切胶40
• 4.3.4 凝胶中回收ssDNA40
• 4.3.5 ELISA法检测克隆子与肝素钠的亲和力40-41
• 4.4 结果和讨论41-42
• 4.5 本章小结42-43
• 第五章 总结与展望43-44
• 5.1 总结43
• 5.2 展望43-44
• 参考文献44-49
• 致谢49

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