多肽修饰的糖脂纳米给药系统抗结肠癌肝转移研究

发布时间：2020-05-07 08:30

【摘要】：肝转移是结肠癌致死的主要原因,常采用肝切除术和化学药物治疗。肝切除术适用范围窄,化学药物脱靶现象严重,副作用大,疗效不明显,因此探索靶向药物治疗方法对结肠癌肝转移的治疗发展具有重要意义。事实上,转移引发的细胞受体数量变化、侵袭能力增加以及扭曲血管等都有可能导致化学药物脱靶现象的发生。本研究旨在探索结肠癌肝转移灶与原位瘤受体数量差异的基础上,构建靶向药物递释系统,通过增加转移灶细胞内的药物浓度,实现结肠癌肝转移的有效治疗。α5β1整合素是一种侵袭性结肠癌细胞表面高表达的脂蛋白受体,与结肠癌肝转移过程密切相关。本研究发现肝转移灶细胞表面α5β1整合素表达量显著高于原位瘤细胞。肝转移肿瘤细胞划痕愈合率和侵袭基质膜的能力都明显强于原位肿瘤细胞。Western blot研究结果显示,在肝转移肿瘤细胞上,基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达量明显增强。脾内注射法评价肿瘤细胞增殖能力,相同时间内,转移灶肿瘤细胞增殖速度快于原位肿瘤细胞。研究结果表明,转移灶肿瘤细胞的侵袭能力强于原位瘤细胞。研究中发现的肝转移肿瘤细胞较原位肿瘤细胞具有更高的α5β1整合素受体表达量,以及更强的侵袭能力,为靶向转移灶药物递释系统的有效设计,提供理论依据。本研究以低分子量海洋生物材料壳聚糖为基本骨架,碳二亚胺为桥链剂,酰胺缩合反应制备壳聚糖硬脂酸嫁接物(Chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,CSOS A)。以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺为交联偶合剂,N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯为桥链剂,合成表面经RPM多肽修饰的壳聚糖硬脂酸嫁接物(RPM peptide modified chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,RPM-CSOSA)。在水性介质中,CSOSA 和RPM-CSOSA嫁接物可自聚集形成胶束,临界胶束浓度分别为79.4μg/mL和94.6μg/mL。微粒粒度与表面电位仪测得CSOSA和RPM-CSOSA嫁接物胶束数均粒径分别为 68.5±0.5nm 和 76.4±2.9nm,电位分别为 27.4±0.35 和 17.1±0.14mV,透射电镜照片显示胶束成类球型,粒径分布均匀。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种广谱的蒽环类细胞毒药物。姜黄素(Curcumin,CUR)是从植物姜黄根茎中提取的多酚类药物,临床上多用作抗癌增敏剂。研究表明,阿霉素和姜黄素联合应用可有效增加细胞内药物浓度,抑制多药耐药,提高抗肿瘤药效。本研究分别选用阿霉素、姜黄素,透析法制备纳米给药系统 RPM-CSOSA/DOX 和 RPM-CSOSA/CUR,药物包封率分别为 86.5%和 45.9%。在PBS(pH 5.0)条件下,进行纳米给药系统的释放动力学研究,与CSOSA纳米给药系统相比,72h内RPM-CSOSA纳米给药系统缓慢释放包封的阿霉素达54.7%,姜黄素的累积释放量达53.2%。激光共聚焦显微镜研究结果表明,RPM-CSOSA胶束通过α5βi整合素受体介导的方式,增加在HT29细胞和HUVEC细胞的摄取,且RPM多肽的修饰增强了胶束对HT29细胞的特异性摄取,减少对正常细胞的毒副作用。体外细胞毒性实验筛选阿霉素与姜黄素最佳协同比例为1:2(w/w)。按上述1:2(w/w)构建联合靶向给药系统(RPM-CSOSA/DOXRPM-CSOSA/CUR),人结肠癌细胞HT29和人脐静脉内皮细胞HUVEC的IC50值,分别为0.81μg/mL和2.62μg/mL,明显低于联合非靶向给药系统(CSOSA/DOXCSOSA/CUR),DOXCUR组。细胞周期分析显示,阿霉素和姜黄素联合应用可将细胞阻滞在G2/M期,联合靶向给药系统的阻滞作用最为明显。体外划痕实验和侵袭实验结果表明,联合靶向给药系统能够显著抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力。通过脾内注射HT29细胞构建结肠癌肝转移动物模型,FITC标记的RPM-CSOSA肝转移灶分布结果表明,RPM多肽修饰能够增加胶束在转移灶肿瘤细胞的分布。模型动物抗肝转移药效学研究结果显示,等剂量的联合靶向给药系统抑制结肠癌肝转移率为87.0%,是联合非靶向给药系统治疗组的1.3倍。免疫组化研究结果显示,与DOX,DOXCUR,联合非靶向给药系统治疗组相比,联合靶向给药系统治疗组的肝转移灶处肿瘤血管密度明显降低。本研究结果表明,根据肝转移灶细胞与原位瘤细胞受体数量差异,设计多肽修饰的纳米药物递送系统,具有较好的肝转移细胞靶向性,增强转移灶细胞的药物分布,提高疗效。同时,阿霉素和姜黄素两药的联合使用,进一步增强靶向制剂的抗转移药效,该主动靶向纳米给药系统的设计,为结肠癌肝转移治疗提供了新的思路。
【图文】：

整合素,细胞,原位,表面

１．３．１肝转移肿瘤细胞表面ａｓｐ，整合素表达量的测定逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法测定原位胖瘤细胞与肝转移灶肿瘤细胞表面ａ５Ｐｉ整合素表达量，逡逑结果如图１．１所示，肝转移灶肿瘤细胞表面ａｓＰｉ整合素表达量显著高于原位肿瘤逡逑细胞。整合素是由ａ、Ｐ亚单位构成的糖蛋白受体，与肿瘤血管生成、侵袭、迁移逡逑和转移等相关［５］。其中，０１５＾整合素是一类在侵袭性结肠癌细胞表面高表达、与纤逡逑连蛋白结合的受体［６，７］。研究表明，0１出１整合素通过调节黏着斑激酶的磷酸化，，增逡逑强肿瘤细胞与肝细胞外基质的黏附作用，促进结肠癌肝转移［２４】。与原位瘤相比，本逡逑研究确认转移灶肿瘤细胞表面ａｓｈ整合素具有高表达特征，提示ａｓｐ，整合素配体逡逑修饰的给药系统，具有靶向转移灶肿瘤细胞的潜在可行性。逡逑ｉ逦ｉｉ逡逑Ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋ｐ１逡逑－逦＾＾逦ＭＭＰ－９逡逑ＶＥＧＦ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑图１．１原位瘤ＨＴ２９细胞（ｉ）和转移灶ＨＴ２９细胞（ｉｉ）表面Ｐ！整合素和转移相关逡逑蛋白灰度处理图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋Ｐｉ，邋ＭＭＰ－９，

划痕实验,原位,细胞的,划痕

划痕法评价肝转移灶结肠癌细胞迁移能力。体外培养形成的单层细胞膜，ｌ0ＨＬ逡逑移液枪枪头划痕致伤，因自身具有迁移能力，划痕两侧肿瘤细胞会向中心迁移。观逡逑察Ｏｈ和４８ｈ的划痕宽度，Ｉｍａｇｅ邋Ｊ计算肿瘤细胞的划痕徖移率。结果如图１．２所逡逑示，４８ｈ内肝转移灶ＣＴ２６细胞的迁移率是原位瘤ＣＴ２６细胞的２．６倍。划痕迁移逡逑率越高
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96

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