纳米淀粉颗粒的制备及与HeLa细胞相互作用研究

发布时间：2020-05-07 17:06

【摘要】：淀粉作为天然多糖类高分子物质,不仅可生物降解,而且具有来源广泛、价格低廉,无生物毒性和免疫原性等优点,成为纳米技术领域研究的重点项目。纵观纳米淀粉颗粒的研究历史,大部分的文献主要集中于制备方法的优化和药物靶向治疗的应用,而针对细胞吞噬不同粒径纳米淀粉颗粒量的研究鲜有文献报道。本实验室在了解相关研究背景基础之上,采用不同方法制备了不同级别的纳米淀粉颗粒,并通过荧光标记技术进一步拓展了纳米淀粉颗粒在细胞领域的应用。研究工作主要包括三个方面的内容:一、纳米淀粉颗粒的制备。本章以大米为原料,利用碱法提取得到大米淀粉,纯度为89.17%,而蛋白质含量仅为0.23%,可忽略不计,对后续荧光标记实验基本无影响。通过采用沉淀法、碱冷冻法、交联法和酸水解法对上述大米淀粉进行微细化处理,分别得到100、200、400、800 nm级的淀粉颗粒。并对纳米淀粉的吸水率、溶液稳定性、糊化性质、形貌特征、红外检测、X-衍射等性质与原大米淀粉进行了比较研究。二、荧光标记淀粉颗粒的制备。以不同级别的纳米淀粉为原料,通过静电结合,在纳米淀粉颗粒上修饰了富含氨基的多聚赖氨酸分子,多聚赖氨酸上的部分氨基基团与荧光分子异硫氰酸荧光素FITC发生反应,制备出了具有FITC荧光标记的纳米淀粉荧光探针,并对该探针进行了荧光光谱扫描、荧光取代度、荧光稳定性、细胞毒性分析。结果表明:纳米淀粉可以在胺化后和FITC结合,达到荧光标记的目的,取代度均满足测试条件且不影响纳米淀粉总体结构,生物活性高。在荧光纳米淀粉浓度小于100μg/mL时,与天然淀粉对HeLa细胞的致死率相当,证明本实验室所制备的荧光纳米淀粉颗粒是一种低毒性的材料,为其在细胞生物学上的应用提供一定的安全性保障。三、HeLa细胞吞噬荧光纳米淀粉颗粒量及溶酶体标记研究。以200 nm级的淀粉颗粒为代表,利用荧光信号同步指示作用,探讨了纳米淀粉的初始浓度、培育时间、培育温度、培养基中有无血清对HeLa细胞吞噬纳米淀粉颗粒量的影响,得到HeLa细胞吞噬纳米淀粉颗粒量的优化条件:在无血清的情况下,纳米淀粉的初始浓度为200μg/mL,培育时间为6h,培育温度为37℃条件下,HeLa细胞吞噬荧光纳米淀粉颗粒的量最大,而且是一个耗能并随时间逐步达到饱和的过程。此外,在优化条件的基础之上,还比较了 HeLa细胞对不同级别荧光纳米淀粉吞噬量的差异,并考察了200nm级淀粉颗粒在细胞中的运输及定位情况。结果表明:HeLa细胞对100、200、400、800 nm级荧光淀粉和荧光原大米淀粉颗粒的吞噬量分别为296.37、322.14、125.52、47.66、3.42 μg/mg,说明粒径较小的纳米淀粉更容易进入细胞,并且纳米淀粉颗粒通过细胞膜表面进入细胞后可很好的定位于溶酶体中,可作为一种新型的溶酶体标记材料。
【图文】：

直链淀粉,结构示意图,支链

淀粉的分子式是（Ｃ６Ｈ１Ｇ０５）ｎ，是由多个葡萄糖单元组成的高分子物质。根据糖苷逡逑键连接位置上的差异，可将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是通过ａ－Ｄ－（ｌ，，４）逡逑糖苷键将小分子葡萄糖单元连接成聚合度高达７０００的线性大分子［３１，结构式如图１．１逡逑所示。有些淀粉的直链淀粉上也有少数的支链存在［４，５］，支链数为５？２１不等［６］。带有逡逑多条支链的直链淀粉的分子质量通常比单一线性直链淀粉的分子量要高。直链淀粉在逡逑新配制的溶液中呈线团结构，稳定性差，容易与溶液中的其它基团络合形成单螺旋结逡逑构，如醇或碘等。在一定条件下，直链淀粉还可以形成双螺旋结构［７】。逡逑ＣＨｚＯＨ逦ＣＨ＾ＩＨ逦１邋ＣＨ？０Ｈ逡逑？邋ＯＨ邋Ｌ邋Ｈ邋0Ｈ邋Ｊｎ邋Ｈ邋0Ｈ逡逑图１．１直链淀粉结构示意图【３】逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａｍｙｌｏｓｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑支链淀粉是一种高度支化的大分子物质，比直链淀粉分子大很多。支链淀粉的主逡逑链是由ｏｔ－Ｄ－（ｌ，４）糖苷键连接的，每间隔２２个葡萄糖单元出现一个支链。支链通过逡逑ｃｔ－Ｄ－（ｌ，６）糖苷键连接，形成一种“树”形结构，聚合度氋达２００００００，分子质量为逡逑１０６－１０７ｇ／ｍｏｌｔ３Ｉ

内部结构模型,淀粉颗粒,淀粉

淀粉的晶体结构逡逑粉是一种半结晶物质，包括结晶区（定形区）和非晶区（无定形区）。结支链淀粉构成，结构较致密，而非晶区主要由直链淀粉构成，结构相对支疏松，这种特殊的半结晶结构对于制备纳米淀粉颗粒是有利的。如图１．３的证明了淀粉内部是由结晶区和非晶区交叉连接的环状结构。其中，淀粉占的比例称为结晶度，而支链淀粉的链长是决定淀粉结晶多态性的重要因此，淀粉晶体类型被分为Ａ、Ｂ和Ｃ型淀粉。Ａ型结构是由２３？２９个葡支链淀粉构成，支链淀粉外部直链与直链淀粉之间形成氢键，这种氢键的直链淀粉存在于Ａ型结构淀粉中。Ａ型结构主要出现在大米、玉米、小谷物淀粉中。Ｂ型结构是由含有３０？４４个葡萄糖单元的支链淀粉构成的，块茎和球根茎类的淀粉中。Ｃ型结构是由含有２６？２９个葡萄糖单元的支链型、Ｂ型结构混合构成的，主要存在于豆类粮食中。研宄表明，当直链０增加到８４％时，结晶度也相应的从４１．８％下降到１７．２％［１Ｚ１３］，淀粉的晶过Ｃ型转到Ｂ型，由此可知，淀粉结晶度会随直链淀粉含量的增加而减
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS231;R96;TB383.1

【参考文献】