嘌呤核苷磷酸化酶合成利巴韦林的应用研究

发布时间：2020-05-08 15:21

【摘要】：利巴韦林是具有广谱抗病毒的核苷类药物,因其具有高疗效、低毒性、不易产生耐药性等特点而被广泛应用于多种病毒疾病治疗中。酶法合成是利用嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌吟核苷与TCA反应生成利巴韦林,具有巨大的工业前景。论文首先对可表达PNPase的乙酰短杆菌的培养条件进行优化,并确定了最佳蛋白胨来源,同时利用响应面法在保证转化率的前提下将菌浓提高到16.8 g/L,提高了25.4%,同时价格降低了28.3%。将三条分别来源于枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和乙酰短杆菌的基因序列与pET20b载体连接构建重组质粒,并在E.coli BL21(DE3)中高效表达得到酶BsPNP、BhPNP和BaPNP。通过对三个重组菌的表达条件进行优化,使目的蛋白表达都占总蛋白的50%以上。利用镍柱亲和层析一步纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE检测确认得到纯酶。通过对三个蛋白酶的酶学性质进行探究,确定上述三个蛋白酶的最适作用温度分别是65 ℃,75 ℃和65 ℃,最适作用pH分别是7.3,7.0和8.0,并确定它们在pH6.0-11.0条件下都具有良好的pH稳定性,温度稳定性趋势也基本一致,其中BhPNP稳定性最佳,在65℃下孵育1 h后酶活力仍有90%,通过测定动力学参数发现BhPNP的催化能力最高。利用乙酰短杆菌和重组菌合成利巴韦林,通过对比,发现重组菌的转化效率远远高于乙酰短杆菌。通过优化合成工艺,将反应时间由10 h缩短为2h,菌体添加量降低了10倍,底物浓度由100 mmol/L提高到400 mmol/L。
【图文】：

用某种产核苷磷酸化酶的微生物作为酶源，在该酶源的作用下核苷类化共同反应生成ＲＢＶ。卩票呤核苷a愃峄�酶（Ｐｕｒｉｎｅ邋Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ邋Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）是最常被用于酶法合成ＲＢＶ的酶，以其催化鸟苷和ＴＣＡ为例，反应过其中，反应式中所使用的ＰＮＰａｓｅ邋ｎｊ■经由乙酰短杆菌ＡＴＣ３９３１１或ＴＱ－９５微生物作为酶源培养并收集得到。虽然实际操作中反应为一步式，，但实际为两步，首先核糖供体核苷需在ＰＮＰａｓｅ的作用下被分解成对应的碱甚以－１－磷酸，然后核糖１－磷酸再与另－？个底物前体物质ＴＣＡ在ＰＮＰａｓｅ的作应合成ＲＢＶ，在这个过程中，包含奋磷酸化和去磷酸化的过程，因此需提供，后并没Q囅�耗磷酸根，但整个反应处于磷酸盐环境中更有利于４８１。微生物酶法相比于化学法合成及发酵法具有以下几个优点：（１）反？６０�

本文编号：2654856