氯化镉对HK-2细胞线粒体功能及PGC-1α、NRF-1蛋白表达的影响

发布时间：2020-05-09 12:12

【摘要】：背景镉(Cd)及其化合物是当前环境中的常见重金属污染物,主要来源于工农业的生产和应用。肾脏作为镉的主要蓄积部位之一,肾近曲小管的Sl段及S2段是镉毒性的主要靶标。氯化镉(CdCl_2)对人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)毒性损伤的影响机制至今尚无定论。线粒体结构和功能的紊乱,可能是镉致肾细胞毒性损伤的早期靶点。作为核转录辅助激活因子的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子(PGC-1α),可增强核受体及相关转录蛋白的活性,在线粒体生物合成和线粒体功能中发挥重要调节作用,但PGC-1α以及PGC-1α参与的相关转录蛋白NRF-1在CdCl_2致HK-2细胞线粒体毒性损伤中的作用尚不清楚。目的探讨氯化镉对HK-2细胞线粒体功能、PGC-1?和NRF-1蛋白表达的影响,以及氯化镉对HK-2细胞线粒体氧化损伤的可能机制。方法1.体外培养处于对数生长期的HK-2细胞,分别暴露于0、10、20、30、40、50、60?mol/L的氯化镉培养基中,以未加氯化镉药物作为对照组。继续培养24h后,使用四唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞的活力。2.采用共聚焦显微镜观察MitoSOX?活细胞荧光染色线粒体ROS生成情况,并用荧光定量分析线粒体ROS平均荧光密度值的变化。3.提取细胞线粒体,采用多功能酶标仪测定线粒体蛋白中线粒体呼吸链复合物III,即辅酶Q-细胞色素C还原酶(ubiquinol cytochrome c oxidoreductase)的活性。4.JC-1染色流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化。5.Western blot法检测细胞总蛋白中PGC-1αNRF-1蛋白表达的情况。结果1.经不同浓度氯化镉处理HK-2细胞24小时后,对照组(0μmol/L)相比,当氯化镉浓度为10?mol/L时,细胞的存活率的下降无统计学意义(P=0.089);氯化镉浓度增加到20?mol/L,细胞存活率下降为(77.60±0.8185)%(P0.01);氯化镉浓度增加为60?mol/L时,细胞的存活率下降为(41.96±1.2220)%(P0.01);并呈明显的剂量依赖相关性。2.细胞经不同浓度氯化镉干预24小时后,与对照组相比,共聚焦显微镜观察HK-2细胞中MitoSOX染色红色荧光逐步增强;经荧光定量分析发现,与对照组相比,氯化镉浓度20?mol/L时,线粒体ROS平均荧光密度值的增高已具有统计学意义(P0.05);氯化镉浓度为30~60?mol/L时,平均荧光密度值增高的趋势更为明显(P0.01)。3.细胞经不同浓度氯化镉干预24小时后,与对照组相比,氯化镉浓度为20?mol/L时,线粒体呼吸链复合物III的活性下降已具有统计学意义(P0.05);氯化镉浓度为40~60?mol/L时,线粒体呼吸链复合物III的活性显著下降(P0.01)。4.细胞经不同浓度氯化镉干预24小时后,随着氯化镉从低到高浓度的增加,JC-1单体阳性率呈逐步上升趋势。与对照组相比,20~60?mol/L的氯化镉浓度组JC-1单体阳性率的相对比值分别为:1.5100±0.1353、1.5800±0.1670、1.7167±0.1305、2.4100±0.1539、3.4733±0.2702(P0.01),提示线粒体膜电位逐步下降。5.细胞经不同浓度氯化镉干预24小时后,氯化镉浓度为20?mol/L时,HK-2细胞总蛋白中PGC-1?蛋白相对表达量低于对照组,差别具有统计学意义(P0.05),CdCl_2为30~60?mol/L时,PGC-1?蛋白相对表达量显著降低(P0.01);CdCl_2浓度为20~60?mol/L,与对照组相比,HK-2细胞总蛋白中NRF-1蛋白相对表达量呈逐步下降趋势(P0.01)。结论1.氯化镉浓度在20~60?mol/L染毒HK-2细胞24小时后,可抑制细胞的存活率,且呈剂量反应关系。2.氯化镉可能与通过抑制HK-2细胞中PGC-1αNRF-1蛋白的表达,引起线粒体呼吸链复合物III的活性下降,促进线粒体ROS的聚集,诱发线粒体膜电位的下降具有相关性,造成对HK-2细胞的毒性损伤。
【图文】：

生物能量,线粒体,和信号

新乡医学院硕士学位论文况。作为细胞能量和 ROS 的主要来源，线粒体也在各种细胞信号传导途径和维细胞代谢中发挥重要作用。Oh 等[13]研究发现，，镉可与线粒体内膜上含巯基的蛋结合，抑制呼吸链中酶的活性，引起线粒体呼吸链功能障碍和 ROS 的增加。近Song[14]等研究指出，镉暴露可使原代近端肾小管上皮细胞线粒体通透性转换（MPTP）开放，破坏线粒体超微结构，引起线粒体凋亡蛋白和因子的激活，以多聚 ADP-核糖聚合酶（PARP）的切割，葛根素可通过恢复膜电位来影响 ATP 产生并通过调节 ANT-1 和 ANT-2 的表达水平以改善镉诱导的 ATP 消耗。我们推测对粒体功能的保护有望成为镉致肾毒性防治的新靶点。

生物发生,线粒体,途径,阿霉素

Yuan 等[17]研究发现阿霉素对心肌细胞毒性损伤中，PGC-1α介导的转录调节能涉及以下三个方面，在线粒体氧化损伤和生物能量平衡中发挥重要作用：加速 TCA 循环和 -氧化，提供更多 NADH 作为电子供体进入 ETC 电子传递调节 ROS 的水平；（3）促进线粒体的生物合成。范飞研究[18]发现对 MPP+SH-SY5Y 细胞氧化损伤的保护，是由于激活的 SIRT1 可通过活化 PGC-1αROS 产生。Fu 等[19]发现，镉暴露于小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)中，FOXO3a 与 PGC1α和超氧化物歧化酶 2(SOD2)启动子的结合亲和力降低。白通过促进线粒体内 SIRT3 的富集及 FOXO3a 介导的线粒体 PGC-1α和 SOD2达的上调，显著降低线粒体 ROS 的生成，提示可能是通过对 SIRT3/ FoxO3a路的活化介导。金鹏等[20]研究发现，阿霉素可能通过抑制 PPARα/PGC-1α轴降低 H9c2 心肌细胞内高能磷酸化合物含量，提示 PPARα/ PGC-1α轴表达的通过提高能量合成来保护 H9c2 心肌细胞。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99

【参考文献】