人诱导多能干细胞分化的心肌细胞在药物致心律失常风险评估中的应用

发布时间：2020-05-16 09:30

【摘要】：目的:药物影响心肌细胞的离子通道,会使动作电位复极化时程延长,在心电图(ECG)上表现为QT间期延长,易诱发早后除极(EAD),增加室性心动过速的风险进而可能引发心性猝死,是新药研发失败和上市后药物撤市的重要原因。因此,检测新化学实体(NCE)对心肌细胞离子通道的影响,评估其潜在的致心律失常风险是新药研发早期安全性筛查的必要内容。近年来研究表明,人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)具有与成年人心肌细胞比较相似的电生理特征,可以解决动物心肌细胞电生理与人类相差很大的种属问题,而且与异源表达细胞系相比,hiPSC-CMs对药物反应更加敏感。因此,近年美国食品药品监督管理局(FDA)联合健康与环境科学研究所(HESI)等国际组织提出了“药物致心律失常体外综合评价(简称CiPA)”这一新模式,而采用hiPSC-CMs在细胞水平直接检测药物致心律失常的风险是其中重要的一部分,可望成为早期心脏安全性筛查的新策略。目前,国内没有国际通用的商业化hiPSC-CMs,只有少数公司在研发hiPSC-CMs,基于该细胞的电生理指标的评价体系尚未见报道。为此,本课题拟利用hiPSC-CMs建立药物致心律失常风险筛查技术平台,有望在新药研发过程中及早发现新药潜在的致命性不良反应,从而合理评估药物的研发前景,这对创新药物的研发具有十分重要的意义。方法:1.免疫荧光染色:对day 7的细胞进行cTNT和α-actin的免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下进行扫描,通过荧光表达情况,对hiPSC-CMs进行验证。2.RT-PCR:使用微量样品总RNA提取试剂盒对hiPSC-CMs的RNA进行提取,逆转录为cDNA后,经RT-PCR检测hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5和Cav1.2的mRNA表达情况。3.全自动心肌细胞多功能检测平台(CardioExcyte 96,德国Nanion Technologies)检测:将hiPSC-CMs按照供应商提供的步骤进行复苏,用纤维连结蛋白包被专用96孔电极板(型号:NSP96-0.6)后,将用台盼蓝染色计数后的细胞悬液以3.0万/孔接种到电极板中。对细胞的base imp(代表细胞贴壁程度)、BR(搏动频率)和FPDc(max)(BR校正后的场电位时程)等主要参数每隔3 h监测一次,持续监测至上述参数达到稳定。稳定后加入高、中、低三种风险药物共12种(由FDA推荐),每种药物设高、中、低三个浓度,每个浓度设三个复孔,在加药后连续监测24 h(前2 h内每5 min监测一次,之后每1 h监测一次),观察药物对hiPSC-CMs场电位的影响并进行计算和统计。结果:1.hiPSC-CMs的验证:在倒置显微镜下观察day 2和day 7细胞,可发现细胞贴壁变大呈梭形,均匀分布在培养皿中形成了单细胞层,并开始同步搏动;通过对day 7细胞荧光染色后,在共聚焦显微镜下可以观察到心肌特异性标志物cTNT和α-actin的荧光;RT-PCR结果显示,对day 1和day 7细胞的RT-PCR验证,包括hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5以及Cav1.2等离子通道在mRNA水平均有表达。综合以上结果可判定诱导分化的细胞为心肌细胞。2.场电位背景数据:在hiPSC-CMs复苏7天后,场电位的各项参数(base imp、BR和FPDc(max))均达到稳定,可以进行后续给药;稳定后的hiPSC-CMs的基本参数BR为60-80/min,FPDc(max)为0.1-0.4 s,与国外文献报道基本一致。3.药物诱发心律失常的情况:实验中可发现药物诱发早后除极和触发电活动(TA)的心律失常现象,后者表现为震荡性除极和不规则搏动两种形式;在给药后出现连续三次以上任意一种上述类型波形都会判定为发生心律失常。高风险药物(苄普地尔、多非利特、奎尼丁、索他洛尔)在中、高浓度几乎全部会诱发心律失常现象,而中、低风险药物(氯丙嗪、西沙必利、特非那定、昂丹司琼、地尔硫卓、雷诺嗪、维拉帕米)中,除美西律外心律失常只见于高浓度。4.药物引发停跳现象:给药后出现超过3小时以上时间的停跳被记为出现停跳现象。高风险药物除索他洛尔外均易引发停跳现象;中风险药物在高浓度易引发停跳现象;低风险药物除美西律外几乎不会出现停跳现象。5.药物引发场电位改变:关于BR和FPDc(max)的统计则是采用自身比较法,将给药后2 h内和24 h内稳定后的数值与给药前的数值进行比较,计算各孔参数的变化率。三类风险药物未见引发上述参数规律性的改变,亦无明显的浓度依赖性改变。6.与国际数据的比较:与国际其他机构的到的数据相比较大部分相符,有小部分数据有所出入。结论:国内商业化hiPSC-CMs对药物反应敏感,以是否出现心律失常现象来看,可区分开高风险药物和中低风险药物,但中低风险药物区分不开;结合停跳现象来看,可较好地区分开高、中、低三种风险药物。
【图文】：

hiPSC-CMs的形态学观察Fig.1ThemorphologyofhiPSC-CMs.(A)Photographofday2andday7.(B)

人诱导多能干细胞分化的心肌细胞在药物致心律失常风险评估中的应用

hiPSC-CMs心脏离子通道的表达Fig.2ExpressionofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMs.(A)PresenceofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMs.(B)ComparisonoftheexpressionofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMsbetweenday1andday7.n=3.*P㩳0.05
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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