吖啶类衍生物LTW02抗肿瘤多药耐药作用及机制研究

发布时间：2017-03-25 07:14

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【摘要】：实验目的:评价新型吖啶类衍生物LTW02的体外抗肿瘤活性及抗肿瘤多药耐药作用,并探讨其作用机制。实验方法:以K562(人白血病细胞)、K562/ADM(耐阿霉素人白血病细胞)为研究对象,MTT法测定K562/ADM的耐药倍数;MTT法检测LTW02的抗肿瘤活性;罗丹明蓄积实验检测LTW02对P-gp功能的影响;Hoechst 33342染色并通过高内涵活细胞成像系统观察LTW02作用后细胞凋亡的形态学变化;PI染色并通过流式细胞仪检测分析LTW02对细胞周期的影响;RH123/Hoechst 33342染色高内涵检测线粒体膜电位;MDC、Lyso-Tracker Red荧光染色法流式检测分析细胞自噬的情况;通过免疫印迹法来检测P-gp、Caspases家族,Bcl-2家族,细胞色素c、p53、LC3、BECN1、m TOR等蛋白的表达,并分析了其相互关系。实验结果:MTT法检测结果显示,阿霉素对敏感细胞株K562的IC50为(1.62±0.10)μg/m L,对耐药细胞株K562/ADM的IC50为(178.14±7.72)μg/m L,耐药倍数为110倍。MTT法检测显示,LTW02对白血病敏感细胞株K562和耐药细胞株K562/ADM均表现出强的细胞毒性,其48 h的IC50分别为(15.09±0.19)μM、(14.96±0.26)μM,并且LTW02对K562/ADM的细胞毒作用呈浓度和时间依赖性。罗丹明蓄积实验结果显示,LTW02能够浓度依赖性增加Rh123在细胞内的蓄积。Western Blot进一步检测到LTW02使K562/ADM细胞中的P-gp的表达降低。Hoechst 33342染色及细胞周期检测均证实,LTW02能浓度依赖性诱导耐药细胞K562/ADM发生凋亡。LTW02作用于细胞后,在形态上可见浓染致密的颗粒状荧光,并有典型的凋亡小体生成。PI染色法显示,LTW02对K562/ADM细胞周期影响不大,但在DNA直方图中出现亚二倍体峰(凋亡细胞峰),并且随着LTW02浓度增加,亚二倍体峰比列增大。为进一步研究LTW02诱导细胞发生凋亡的机制,通过RH123/Hoechst 33342染色来检测线粒体膜电位,高内涵检测结果显示,LTW02能够下调K562/ADM细胞线粒体膜电位。Western Blot分析证实,LTW02可以通过改变细胞线粒体膜电位导致线粒体释放细胞色素c,细胞色素c进入细胞之后,激活Caspases-9、Caspases-3,启动线粒体凋亡途径。我们还发现LTW02下调抑凋亡蛋白Bcl-2,上调促凋亡蛋白Bax,导致Bcl-2家族成员抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比值下降,使耐药细胞K562/ADM发生凋亡。另外,LTW02还可以上调p53的表达。MDC染色及Lyso-Tracker Red染色法均证实,LTW02能够诱导K562/ADM细胞发生自噬。通过Western Blot分析可知,经LTW02处理后的细胞,自噬相关蛋白BECN1表达增多,LC3Ⅰ型向Ⅱ型转化增多。另外,我们还发现m TOR表达减少。结论:吖啶类衍生物LTW02对多药耐药细胞株K562/ADM的生长有明显的抑制作用,其通过抑制P-gp的功能及表达,诱导K562/ADM细胞发生凋亡和自噬,发挥抗K562/ADM细胞多药耐药作用。
【关键词】：吖啶类衍生物 多药耐药 P-糖蛋白 凋亡 自噬
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 文献综述12-26
• 1 引言12
• 2 吖啶类化合物的研究进展12-14
• 2.1 概述12-13
• 2.2 吖啶类化合物在医药领域的研究现状13-14
• 2.3 吖啶类化合物的抗肿瘤研究进展14
• 3 多药耐药的形成机制14-17
• 3.1 MDR基因及其编码的P-糖蛋白高表达14-15
• 3.2 相关蛋白介导的多药耐药15-17
• 3.3 酶介导的多药耐药17
• 4 细胞死亡17-20
• 4.1 细胞凋亡17-18
• 4.2 细胞自噬18-20
• 参考文献20-26
• 第二章 LTW02对K562和K562/ADM细胞增殖的影响26-36
• 1 实验材料26-28
• 1.1 肿瘤细胞株26
• 1.2 试剂及主要溶液的配制26-27
• 1.3 主要仪器27-28
• 2 实验方法28-30
• 2.1 细胞株的复苏28
• 2.2 细胞株的培养28
• 2.3 细胞株的冻存28-29
• 2.4 倒置相差显微镜观察耐药细胞K562/ADM形态29
• 2.5 MTT比色法检测耐药细胞K562/ADM的耐药倍数29
• 2.6 MTT比色法检测LTW02对K562和K562/ADM细胞的增殖作用29-30
• 2.7 统计分析30
• 3 实验结果30-32
• 3.1 倒置相差显微镜观察耐药细胞K562/ADM的形态30
• 3.2 阿霉素对K562及K562/ADM细胞的毒性30-31
• 3.3 LTW02对K562和K562/ADM细胞增值的影响31-32
• 4 讨论32-33
• 5 小结33-34
• 参考文献34-36
• 第三章 LTW02抗肿瘤多药耐药机制研究36-62
• 第一节 LTW02对耐药细胞K562/ADM P-gp的影响36-44
• 1 实验材料36-38
• 1.1 肿瘤细胞株36
• 1.2 试剂及主要溶液的配制36-38
• 1.3 主要仪器38
• 2 实验方法38-40
• 2.1 罗丹明蓄积实验38
• 2.2 Western Blot检测P-gp的表达38-40
• 2.3 统计分析40
• 3 实验结果40-42
• 3.1 LTW02对耐药细胞P-gp功能的影响40-41
• 3.2 LTW02对耐药细胞P-gp表达的影响41-42
• 4 讨论42-43
• 5 小结43-44
• 第二节 LTW02诱导耐药细胞K562/ADM凋亡的研究44-52
• 1 实验材料44
• 1.1 肿瘤细胞株44
• 1.2 试剂及主要溶液的配制44
• 1.3 主要仪器44
• 2 实验方法44-46
• 2.1 Hoechst33342染色法观察细胞核形态44-45
• 2.2 PI染色法检测细胞周期45
• 2.3 Rh123/ Hoechst33342检测细胞线粒体跨膜电位的变化45
• 2.4 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达45
• 2.5 统计分析45-46
• 3 实验结果46-50
• 3.1 LTW02对耐药细胞K562/ADM形态学的影响46
• 3.2 LTW02对耐药细胞K562/ADM细胞周期的影响46-47
• 3.3 LTW02对耐药细胞线粒体跨膜电位的影响47-48
• 3.4 LTW02对耐药细胞凋亡相关蛋白的影响48-50
• 4 讨论50-51
• 5 小结51-52
• 第三节 LTW02诱导耐药细胞K562/ADM自噬的研究52-58
• 1 实验材料52
• 1.1 肿瘤细胞株52
• 1.2 试剂及主要溶液的配制52
• 1.3 主要仪器52
• 2 实验方法52-53
• 2.1 MDC染色法检测细胞的自噬情况52-53
• 2.2 Lyso-Tracker Red染色法检测细胞的自噬情况53
• 2.3 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达53
• 2.4 统计分析53
• 3 实验结果53-56
• 3.1 LTW02对耐药细胞K562/ADM的自噬诱导作用53-54
• 3.2 LTW02对耐药细胞K562/ADM溶酶体的影响54-55
• 3.3 LTW02对耐药细胞自噬相关蛋白的影响55-56
• 4 讨论56-57
• 5 小结57-58
• 参考文献58-62
• 附录62-64
• 英文缩略表62-64
• 致谢64-65

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本文编号：266853