腺苷A1受体介导的PI通路在酒精性肝纤维化大鼠星状细胞模型中的作用

发布时间：2017-03-25 07:05

  本文关键词：腺苷A1受体介导的PI通路在酒精性肝纤维化大鼠星状细胞模型中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酒精性肝病是一种由于长期大量饮酒所导致的肝脏类疾病。其疾病谱较广,从脂肪肝到肝硬化甚至肝癌,而酒精性肝纤维化是这个过程中重要的一环。如何预防甚至逆转酒精性肝纤维化的发生已愈来愈受到关注。在酒精性肝纤维化发生过程中,酒精在肝脏中的代谢物乙醛可激活肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),HSC的活化会刺激产生细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。因此,HSC的活化增殖是酒精性肝纤维化发生的中心环节。随着对腺苷及其受体研究的逐步深入,人们认识到腺苷受体(adenosine receptor,AR)在肝脏疾病中发挥着重要作用。本课题组前期研究表明咖啡因作为非选择性AR拮抗剂不仅能显著抑制大鼠酒精性肝纤维化模型中肝纤维化的发生,同时内外研究表明还能显著抑制乙醛诱导的HSC活化。前期研究还显示A1R和A2AR拮抗剂均可抑制酒精性肝纤维化中HSC的活化增殖但二者对c AMP-PKA-CREB通路有相反的调节作用,其中A2AR所介导的c AMP-PKA-CREB通路作用占主导优势。目前认为,在酒精依赖形成过程中,由G蛋白耦联受体介导的c AMP信号通路和磷脂酰肌醇(PI)信号通路是介导酒精效应的细胞内主要靶点,其中PI通路的关键信号分子DAG和PKC也均是调节细胞增殖的重要环节。所以,我们推测腺苷A1受体在酒精性肝纤维化中可能通过介导PI通路来调控HSC的活化增殖且与c AMP信号通路有信号交联作用。为进一步验证这一假设,本研究采用乙醛刺激HSC-T6细胞建立酒精性肝纤维化HSC模型,在此基础上观察腺苷A1受体介导的PI通路在调控HSC活化增殖中的作用以及与c AMP-PKA信号通路的交联作用。研究内容主要包括以下几个部分:1.A1R在酒精性肝纤维化细胞模型中表达增加我们首先通过乙醛(200μM)刺激HSC-T6 48h建立酒精性肝纤维化模型,检测其A1R的表达。Real Time PCR及Western blot结果显示:正常组及肝纤维化模型组中均有A1R表达且模型组中A1R m RNA和蛋白水平显著高于正常组。2.si RNA沉默A1R对HSC活化增殖的影响实验分为正常组、模型组、A1R si RNA组和阴性对照组。根据A1R基因序列设计并合成si RNA,脂质体法转染进HSC中。MTT结果显示转染组HSC活力显著下降,表明沉默A1R可显著抑制已活化的HSC活力。进一步采用Real Time PCR检测α-SMA和Collagen I m RNA的表达,Western blot法检测α-SMA和Collagen I蛋白的表达。实验结果显示转染组α-SMA、Collagen I m RNA及蛋白表达水平明显降低,而阴性对照组表达无显著差异,这表明靶向封闭A1R基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。3.AR介导的PI信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC中的作用实验分为正常组、模型组、UTP组(IP3的前体物质,介导Ca2+释放)、非选择性AR激动剂NECA组和UTP+NECA组。除正常组外,其余各组用乙醛(200μM)作用24h以制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。UTP组给予UTP(100μM)处理24h,NECA组给予NECA(10μM)处理24小时,UTP+NECA组同时给予UTP(100μM)和NECA(10μM)处理24小时。采用ELISA法检测各组HSC内IP3的含量,Western blot法检测各组HSC内PLC蛋白的表达。激光共聚焦显微镜检测各组HSC胞内Ca2+的表达。结果显示,与正常组比较,模型组IP3含量、其信号中关键信号分子PLC蛋白表达及胞内Ca2+的表达明显升高,同时UTP组与NECA组结果较模型组显著升高,且UTP预处理显著增强NECA的效应。结果提示,在HSC存在PI信号通路。随后进一步用Real Time PCR检测α-SMA和Collagen I m RNA的表达,Western blot检测α-SMA和Collagen I蛋白的表达。实验结果显示UTP组、NECA组和UTP+NECA组α-SMA、Collagen I m RNA及蛋白表达水平明显升高,且UTP预处理显著增强NECA的效应。这表明AR介导的PI通路在HSC细胞的活化增殖中有调节作用。4.A1R介导的PI通路在A1R拮抗剂抑制HSC活化增殖中的作用在前期研究中已发现A1R拮抗剂抑制HSC活化增殖的基础上,为进一步阐明A1R介导的PI通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用,实验分为正常组、模型组、A1R激动剂CPA、A1R拮抗剂DPCPX组和CPA+DPCPX组。除正常组外,其余各组用乙醛(200μM)作用24h以制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。CPA组给予CPA(1μM)处理24h,DPCPX组给予DPCPX(10n M)处理24h,CPA+DPCPX组同时给予CPA(1μM)和DPCPX(10n M)处理24小时。采用激光共聚焦显微镜检测各组HSC内Ca2+的表达,ELISA法检测各组HSC内IP3、DAG的含量,Western blot法检测各组HSC内PLC、PKC蛋白的表达。结果显示,经CPA处理后,模型组HSC中胞内Ca2+的表达,IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表达上升。而DPCPX作用后HSC中胞内Ca2+的表达,IP3、DAG含量及PLC、PKC蛋白表达下降。同时,与单独用药组比较,CPA+DPCPX联合用药组上述作用均可逆转。结果表明A1R调控的PI通路在乙醛诱导的HSC活化增殖中具有一定作用。5.PLC-PKC信号通路与c AMP-PKA信号通路的信号交联实验分为正常组、模型组、PKC激动剂PMA组、PKC抑制剂SC-3088组共同孵育大鼠HSC,比较不同组别HSC活化增殖情况,采用Elisa法检测各组HSC内c AMP的含量,Western blot法检测各组HSC内PKA蛋白的表达。考察PKC活性的升高或降低对c AMP含量和PKA活性的影响。结果显示PMA组α-SMA、Collagen I的表达、c AMP的含量和PKA蛋白的表达较模型组明显增强,而经SC-3088处理后显著下降。再将实验分为正常组、模型组、PKA激动剂FSK组、PKA抑制剂H89组共同孵育大鼠HSC,比较不同组别HSC活化增殖情况,Western blot法检测各组HSC内PLC、PKC蛋白的表达。考察PKA活性的升高或降低对PLC、PKC活性的影响。结果显示FSK组α-SMA、Collagen I的表达、PLC、PKC蛋白的表达较模型组明显增强,而经H89处理后显著下降。阐明PLC-PKC信号通路与cAMP-PKA信号通路互为正向调节。综上所述,在大鼠酒精肝纤维化HSC模型中,A1R表达较正常HSC增强。沉默A1R基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖,A1R调控的PI通路在乙醛诱导的HSC活化增殖中具有一定作用且与c AMP-PKA信号通路有交联作用。
【关键词】：肝纤维化 乙醛 肝星状细胞 腺苷 腺苷受体 信号交联
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中英文缩略词对照6-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 1.前言16-17
• 2.实验材料17-22
• 2.1 实验细胞株17
• 2.2 主要试剂17-19
• 2.3 仪器与设备19
• 2.4 溶液和试剂的配制19-21
• 2.5 引物基因序列21
• 2.6 图像分析软件21-22
• 3.实验方法22-29
• 3.1 HSC细胞培养及传代22
• 3.2 大鼠酒精性肝纤维化HSC模型的建立22
• 3.3 A1R-si RNA转染HSC22-23
• 3.4 MTT试验23
• 3.5 ELISA法检测c AMP、DAG、IP3含量23-24
• 3.6 激光共聚焦检测胞外刺激下Ca2+内流变化24
• 3.7 细胞总RNA的提取24-25
• 3.8 Real Time PCR25-26
• 3.9 Western Blot26-28
• 3.10统计学分析28-29
• 4.结果29-47
• 4.1 腺苷A1受体在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的表达情况29-30
• 4.2 转染沉默腺苷A1受体对乙醛诱导的肝星状细胞活化增殖的影响30-32
• 4.3 腺苷受体介导的PI信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC中的作用32-36
• 4.4 腺苷A1受体调节剂对大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中PI信号通路的影响36-42
• 4.5 PLC-PKC信 号通路与c AMP-PKA信 号通路的交联作用42-47
• 5.讨论47-51
• 6.结论51
• 参考文献51-58
• 附录58-60
• 致谢60-61
• 综述61-71
• 参考文献66-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈莲香;舒建昌;;PDGF与肝纤维化关系的研究新进展[J];胃肠病学和肝病学杂志;2011年01期

2 黄艳;黄成;李俊;;肝纤维化病程中Kupffer细胞分泌的细胞因子对肝星状细胞活化增殖、凋亡的调控[J];中国药理学通报;2010年01期

3 代雪飞;吕雄文;管文婕;杨万枝;李俊;;咖啡因对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖、凋亡的影响及部分作用机制[J];安徽医科大学学报;2011年08期

  本文关键词：腺苷A1受体介导的PI通路在酒精性肝纤维化大鼠星状细胞模型中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：266816