磁珠固定二氢叶酸还原酶指数富集筛选混合物中低丰度高亲和力配体

发布时间：2020-05-17 16:04

【摘要】：筛选混合物库发现药物先导化合物较传统逐一合成纯化合物库再筛选具有显著成本和效率优势,前期建立了指数富集筛选混合物库新技术,为明确其筛选混合物库中低丰度药用级亲和力配体的适用性,本文以磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacterium tuberculosis DHFR,MtDHFR)为药靶,建立了指数富集筛选混合物中低丰度MtDHFR高亲和力配体体系,并初步应用于组合合成及天然产物混合物中预期配体的筛选。表达靶蛋白Mt DHFR并Ni~(2+)-NTA磁珠固定化及表征;构建N端带6×His标签MtDHFR的表达质粒pET28a:dfrA,在E.coli BL21(DE3)中成功重组表达并进行酶学性质表征。利用6×His标签与Ni~(2+)-NTA磁珠螯合固定6×His-MtDHFR,发现Ni~(2+)-NTA磁珠对MtDHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但固定酶活性保留不超过32%;进一步研究发现Ni~(2+)显著抑制酶活性,且EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,而Fe~(3+)无显著干扰。通常Ni~(2+)-NTA鳌合带6His标签酶复合物在pH 8.0及以上才能维持稳定;但6His-Mt DHFR在pH 8.0时保留的活性很低。因此,Ni~(2+)-NTA磁珠鳌合固定方案不适于固定化MtDHFR用于磁分离筛选配体混合物库。羧基磁珠固定化MtDHFR及表征。晶体结构(PDB code:4KNE)显示,Mt DHFR氨基酸序列仅有1个赖氨酸(Lys-53)及N端伯氨基,都远离活性位点,因此,可通过此氨基与磁珠表面活化羧基生成酰胺固定化。羧基磁珠固定化MtDHFR的容量为(8.6±0.6)mg/g磁珠(n=3),相对于游离酶活性,固定酶保留活性(87±4)%(n=3);游离和固定化MtDHFR在反应缓冲液中0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%,羧基磁珠固定化MtDHFR活性下降仅约35%,可见固定酶储存稳定性比游离酶显著提高,且MtDHFR羧基磁珠固定前后对抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的IC_(50)无显著性差异(P0.05)。因此,此羧基磁珠固定化MtDHFR方案满足配体混合物库中高亲和力配体的选择性指数富集与筛选要求。基于固定化Mt DHFR为靶指数富集筛选配体混合物体系建立及初步应用。以典型抑制剂MTX为母体设计合成不同亲和力的系列衍生物。通过人工混合构成含MTX约1%的模拟混合物,外加参考配体,构成筛选前样品。以羧基磁珠固定MtDHFR为靶,通过降低靶蛋白用量至配体平均结合率低于10%,并使配体混合物发生竞争结合而选择性富集高亲和力配体,以前一轮提取所得配体混合物用于后一轮的筛选前样品,连续两轮迭代筛选,验证了含量为1%的高亲和力配体MTX的指数富集效应。进一步以MTX和芳酸混合物与胺及醇混合物组合合成成分复杂的含有痕量残留MTX的混合物,应用此系统经过两轮迭代筛选,实现了痕量残留MTX的指数富集。以中药材姜黄提取物,适当稀释后外加痕量候选配体MTX和参考配体组成天然产物模拟混合物筛选前样品,同样经两轮筛选可实现选择性富集天然产物混合物中的高亲和力痕量MTX。综上所述,通过重组表达Mt DHFR并优化磁珠固定化方案,在模拟混合物验证了预期高亲和力配体的指数富集效应,并成功应用于组合合成混合物及天然混合物中含量低于1%亲和力为纳摩尔级配体的选择性富集筛选。由此明确了磁分离迭代指数富集筛选混合物中痕量纳摩尔级亲和力药用配体的适用性,进一步优化将有望用于从现有抗结核活性中草药中发现高亲和力先导配体。
【图文】：

质粒,图谱,基因序列,氨基酸序列

图 1-1 质粒 pET28a-4KNE 图谱Fig. 1-1 Map of Plasmid pET28a-4KNE图 1-2重组MtDHFR基因序列比对(A)和氨基酸序列比对(B)Fig.1-2 Gene sequence (A) and amino acidsequence alignment (B) of recombinantMtDHFR Sequence0:重组序列；Sequence1:GenBank(Gene ID: 887777)，PDB(4KNE)3.2 MtDHFR 表达和纯化

氨基酸序列,基因序列,氨基酸序列,结核分枝杆菌

质粒 pET28a(+):dfrA(图 1-1)经转化后挑单克隆菌进行测序鉴定，通过DNAssist Version 2.2 比对，其结果与 GenBank 中结核分枝杆菌(H37Rv)全基因组数据库检索的基因序列一致 (图1-2A)，其编码氨基酸序列与重组MtDHFR的氨基酸序列同源性达 100% (图 1-2B)；因此，，可以确定 dfrA 基因已成功克隆到载体pET28a，质粒构建正确。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914

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