酸响应型线粒体靶向纳米制剂的构建及其在哮喘治疗中的应用研究

发布时间：2020-05-21 20:32

【摘要】：哮喘作为一种全球性的严重疾病,目前其一线治疗方式为吸入糖皮质激素。而部分哮喘患者体内炎症细胞聚集类型不同,无法通过传统药物缓解症状。ABT-199小分子作为Bcl-2抗凋亡蛋白的抑制剂,可抑制哮喘炎症相关细胞线粒体表面过表达的Bcl-2抗凋亡蛋白活性,进而诱导炎症细胞凋亡。然而ABT-199小分子药具有很强的疏水性,且对细胞线粒体无靶向性,这大大影响了其药物疗效,因此亟需发展新的药物递送体系实现其有效递送。纳米给药系统可以实现药物的高效递送和炎症相关细胞及胞内的靶向,为哮喘疾病的治疗提供了一种新思路。针对炎症相关疾病病灶区域微环境具有微酸性及细胞溶酶体内部酸性特点,本论文设计了具有酸响应性的纳米载体。通过制备具有酸响应能力的两亲性高分子,在水中与疏水性药物形成载药胶束,以哮喘作为疾病模型进行对酸响应纳米制剂Nf-ABT-199治疗效果的探究。本论文首先合成了具有酸响应性的高分子。通过具有两亲性及高度生物安全性的氨基聚乙二醇高分子链作为R-氨基酸N碳酸酐开环聚合反应(ROP)的引发剂,连接聚氨基酸链。并通过简单的氨解反应引入对酸敏感的咪唑基团,最终得到了酸响应型嵌段高分子,并通过核磁共振波谱法对合成的酸响应型嵌段高分子进行结构确认;利用紫外分光光度计(UV-vis)测定酸响应型嵌段高分子的透射率随pH值的变化以研究其酸响应性。当环境pH值下降至其酸解离常数(pKa)时,其基团质子化可引起表面电位的正增强,从而提高药物入胞,且通过静电作用可进一步靶向线粒体。随后,本论文利用上述合成的酸响应型嵌段高分子,包载Bcl-2抗凋亡蛋白抑制剂ABT-199小分子药物,制备了肺部炎症细胞内酸环境响应型线粒体靶向的ABT-199纳米制剂(Nf-ABT-199),并进一步用于哮喘疾病的治疗研究。同时,制备了不含ABT-199药物的纳米载体(Nanocarrier),作为后续实验对照。采用紫外分光光度计建立ABT-199含量测定方法学,并对Nf-ABT-199的理化性质及载体载药量进行考察;利用Zeta电位分析仪检测Nf-ABT-199在不同pH条件下的电位变化,利用透射电子显微镜(TEM)、粒度电位分析仪(DLS)等手段考察其形貌、粒径的酸响应性变化。结果表明,Nf-ABT-1 99具有良好的酸响应性。在较低的pH环境下,Nf-ABT-199表面电位上升呈现强正电性,纳米粒体积膨胀。随后,在细胞水平对Nf-ABT-199的胞内溶酶体逃逸行为进行考察。结果显示,Nf-ABT-1 99进入细胞后发生溶酶体逃逸现象,确认了其胞内行为。Nf-ABT-199纳米制剂入胞后,在溶酶体的酸性环境中质子化,通过质子海绵效应从溶酶体中逃逸,随后靶向线粒体。接着,在细胞水平对Nf-ABT-199的线粒体靶向性能进行评价,与非响应型的纳米制剂(is-Nf-ABT-199)进行对照。之后通过定量分析,比较不同实验组给药后细胞线粒体上的药物含量差异,对比靶向能力。结果表明,Nf-ABT-199能靶向细胞线粒体,在线粒体部位富集。进一步,建立卵清白蛋白诱导的急性嗜酸性粒细胞型哮喘小鼠模型,以气道滴注方式给药。通过统计肺部炎症细胞数、相关炎症因子水平、肺部组织切片染色、考察炎症细胞凋亡情况等手段,对比ABT-199游离药、is-Nf-ABT-199及Nf-ABT-199的治疗效果。结果表明:1.Nf-ABT-199具有良好的肺部扩散行为,能深入肺部深处,针对小气道部位的炎症治疗效果显著;2.Nf-ABT-199能有效减少肺部炎症细胞数,降低相关炎症因子水平并显著降低支气管及血管周围浸润现象,同时减少杯状细胞产生,且能有效缓解哮喘小鼠的气道高反应性。且纳米载体本身不影响小鼠的炎症情况;3.Nf-ABT-199干预后的炎症细胞表达casepase 3凋亡通路,引起炎症细胞显著凋亡。对Nf-ABT-199及纳米载体的生物安全性进行考察。利用CCK8法探究两者对人支气管上皮样细胞HBE的细胞毒性;流式分析术考察HBE细胞给药后的凋亡情况;评估钙依赖性跨膜糖蛋白(E-Cadherin)的损伤情况;测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)的水平以考察其肝毒性,并记录分析实验小鼠造模及给药期间的体重情况,考察其安全性。结果表明:1.Nf-ABT-199及纳米载体均未对人支气管上皮样细胞造成毒性损害,不造成细胞的凋亡;2.Nf-ABT-199及纳米载体均未造成E-Cadherin损伤,对气道上皮无毒性作用;3.Nf-ABT-199及纳米载体对动物均不造成肝毒性也不影响小鼠正常体重变化。综上,本文设计合成的纳米载体包载药物可得到酸响应型线粒体靶向纳米制剂(Nf-ABT-199)。Nf-ABT-199具备纳米尺寸并大大提高药物水溶性,促进药物的体内递送。并且,纳米载体协助共载药物在肺部炎症部位深入、富集,实现气管内特异性。同时利用其酸响应的电位增强性质,使其能从溶酶体酸性环境中逃逸并进一步通过静电作用实现有效的线粒体靶向递送药物。进而增强对Bcl-2抗凋亡蛋白的抑制作用,导致炎症细胞凋亡。另外,Nf-ABT-199及纳米载体具有生物安全性。这种酸响应的线粒体靶向纳米给药体系,可以为设计开发更多细胞器相关靶向药物提供新思路。
【图文】：

示意图,靶向,制剂,炎症细胞

位优势靶向目标细胞器，实现药物的有效递送［４８￣４９］。逡逑本章设计并合成了具有酸响应性的纳米载体，进一步包载ＡＢＴ－１９９药物，制逡逑备了酸响应型线粒体靶向的ＡＢＴ－１９９纳米制剂（图２．１）。通过核磁共振波谱法逡逑ＣＮＭＲ）对合成的酸响应型嵌段高分子进行结构特征分析；利用透射电子显微镜逡逑（ＴＥＭ）、粒度电位分析仪（ＤＬＳ）等手段考察其形貌、粒径的酸响应性变化；并逡逑在细胞水平上验证其在细胞内的线粒体靶向行为。逡逑■■曊逡逑！［言逡逑图２．１炎症细胞内酸响应型线粒体靶向的ＡＢＴ－１９９纳米制剂的制备示意图。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ａ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ邋ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｔａｒｇｅｔｅｄ逡逑６逡逑

路线图,天冬氨酸,路线图,酸酐

２．２＿２邋ＰＥＧ５ｋ－ｐ（ＡＰＩ－Ａｓｐ）５邋的合成逡逑２．２．２．１天冬氨酸环内酸酐的合成逡逑天冬氨酸环内酸酐的合成路线如图２．２所示。利用金属钠块对四氢呋喃除水，逡逑以二苯甲酮作为显色剂使用，，当溶液颜色变为蓝色时，开始蒸馏收集，得到无水逡逑四氢呋喃。将９邋ｇＬ－天门冬氨酸Ｐ－苄酯和９邋ｇ三光气一起溶于上述除水的无水四氢逡逑呋喃中（１５０邋ｍｌ），６５°Ｃ油浴加热，搅拌反应３邋ｈ。之后停止反应，将溶液至于室温逡逑中冷却。将冷却后的反应溶液用油相滤膜进行过滤，之后缓慢滴入正己烷中。产逡逑物在正己烷中沉淀，之后用布氏漏斗及双层滤纸对其进行过滤。滤后，产物置于逡逑真空干燥箱中，室温干燥过夜。将产物收集、称重，得到天冬氨酸环内酸酐逡逑（ＢＬＡ－ＮＣＡ）0逡逑0逡逑ＣＩ３Ｃ．逦／ＣＣＩ３逡逑ｒ邋１逦0邋Ｗ＝逡逑Ｌ－天门冬氨酸ｐ－苄酯逦ＢＬＡ－ＮＣＡ逡逑图２．２天冬氨酸环内酸酐合成路线图。逡逑９逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96

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