紫外可见分光光度法测定庆大霉素含量的方法建立及与管碟法的比较研究

发布时间：2020-05-30 06:27

【摘要】：庆大霉素是多组分混合物,在采用管碟法测定其含量时,常常存在标准品与样品之间不同质问题。因此,需要建立新的庆大霉素含量测定的方法并与管碟法进行比较。经过查阅文献,发现近年来庆大霉素的含量测定方法有微生物检定法、旋光法、光谱法、色谱法等。与管碟法比较,旋光法与光谱法也可以测定庆大霉素全部组分的含量,但旋光法的灵敏度太低。通过对光谱法的比较分析,发现紫外可见分光光度法具有灵敏度高、检测快速等优点,这可以作为建立庆大霉素含量测定方法的研究方向。根据庆大霉素的化学性质,本文寻找到化学性质稳定的水杨醛试剂。经过试验发现,水杨醛与庆大霉素在常温下发生衍生化学反应,且衍生产物在400nm波长处有最大紫外可见吸收。采用单因素多水平设计方法,优化反应条件。结果显示水杨醛与庆大霉素在pH5.5的磷酸盐缓冲液中,经过50℃水浴20分钟,衍生产物的吸收度值最大,实验条件最佳。采用最佳实验条件,依据《中国药典》规定的指导原则,进行紫外可见分光光度法测定庆大霉素含量的方法学验证。结果显示本方法的特异性好;在280～519 U/ml的浓度范围内,衍生产物的吸光度值(A)与庆大霉素浓度值(C)之间具有良好的线性关系,标准曲线A=0.0007C+0.0186,R 值达到 0.999;平均回收率为 100.09±0.8%,RSD 为 0.7%(n=7);衍生产物在0～10分钟内稳定。同时,采用管碟法测定庆大霉素的含量。按照菌悬液制备、培养基制备、灭菌、供试液制备、双碟制备、滴加供试液、培养、抑菌圈测量的流程进行试验,并将测量的抑菌圈直径按照生物检定统计法进行可靠性检测、可信限率及效价计算。独立平行实验4次。结果显示,1次实验结果的可靠性检测参数试品间(F1)不符合判定要求;1次实验结果的可信限率为7.96%,不符合硫酸庆大霉素注射液标准规定(不超过7%)的要求;含量结果平均值为 101.10%,RSD 为 1.7%(n=4)。最后,将紫外可见分光光度法与管碟法进行比较研究。首先分别用紫外可见分光光度法与管碟法测定硫酸庆大霉素注射液中庆大霉素的含量,并将各自检测结果进行比较:然后将紫外可见分光光度法与管碟法的方法学验证结果、硫酸庆大霉素注射液中庆大霉素含量测定结果的显著差异性进行比较。结果显示紫外可见分光光度法测定庆大霉素含量平均值为100.43%,RSD为1.2%(n=104);管碟法测定庆大霉素含量的平均值为101.10%,RSD为1.7%(n=4);紫外可见分光光度法的线性与范围为280～519 U/ml、线性关系R值为0.999、回收率为100.09%±0.8%、RSD为0.7%;管碟法的线性与范围为2～12 U/ml、回收率为100.80%±1.5%/98.7%±1.5%、RSD为1.7%;根据t分布检验法,在P0.05的置信区间内,t=0.88,小于 1.98[t(0.05,106)]。本文建立紫外可见分光光度法测定庆大霉素含量的方法,具有检测快速,操作方便的特点。同时方法的特异性好、灵敏度与准确度高、重现性好,但是衍生产物的稳定性欠佳。与管碟法比较,两个方法的结果无显著性差异,但紫外可见分光光度法的准确性与重现性更优。因此,紫外可见分光光度法满足庆大霉素含量测定的常量分析要求,能为控制其质量提供新的参考依据,进而保障庆大霉素使用的安全性与有效性。
【图文】：

分子结构图,庆大霉素,分子结构,组分

在结构上均是由２－脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成，其中２－脱氧链霉胺属逡逑于氨基糖，绛红糖胺、加拉糖胺属于氨基环醇。２－脱氧链霉胺分别在４、６位上通过氧桥与逡逑绛红糖胺、加拉糖胺连接。其结构式见图１。逡逑Ｒ邋ＨＯ邋逦逦0逡逑ｈ２ｎ，逡逑图１庆大霉素组分分子结构逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ逡逑从结构分析，庆大霉素组分分子结构中无共轭体系，不会产生紫外可见或荧光吸收，逡逑无法直接运用紫外可见分光光度计或荧光光度计检测，但所有组分均含有伯氨基，其中ｃ２、逡逑ｃ２ａ、ｃ２ｂ是同分异构体，均可发生伯氨基的化学反应。逡逑因此，可根据席夫碱反应原理，利用庆大霉素各组分均具有氨基的结构性质，与水杨逡逑醛进行衍生反应，通过优化条件，探索与建立紫外可见分光光度法测定庆大霉素含量的新逡逑方法。逡逑１材料逡逑１．１紫外可见分光光度法材料逡逑１．１．１试剂逡逑磷酸氢二钾，ＡＲ，邋５００ｇ，汕头市西陇化工厂有限公司；磷酸二氢钾，ＡＲ，５００ｇ，上海逡逑凌峰化学试剂有限公司；乙酸（冰乙酸）

紫外可见分光光度法,衍生化,最大吸收波长,产物

３．１．１最大吸收波长的确定逡逑以波长（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）为横坐标，溶液的吸光度（Ａｂｓ）为纵坐标，庆大霉素与水杨醛衍生逡逑化反应的产物在４００±２ｎｍ波长处有最大吸收峰（见图２）。因此，庆大霉素与水杨醛衍生逡逑化反应的产物的最大吸收波长为４００ｎｍ，可作为紫外可见分光光度法的检测波长。逡逑Ｏ．邋５邋－逡逑Ｏ．邋４邋－逦．逡逑Ａ逦：逡逑ｔ）邋0？邋３邋－逦＾逦逦－逡逑日：：：－逡逑０．０邋１邋逦－邋－逦邋１逡逑３６０逦３７０逦３８０逦３９０逦４００逦４１０逦４２０逦４３０逦４４０逦４５０逦４６０逡逑ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ〉逡逑图２紫外可见分光光度法测定衍生化产物的最大吸收波长逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｘｉｍｕｍ邋ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ邋ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋ｏｆ逡逑ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ邋ｂｙ邋ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ逡逑３．１．２反应温度的选择逡逑在４００ｎｍ波长处分别检测３０°Ｃ、４０°Ｃ、５０°Ｃ、６０°Ｃ、６５°Ｃ水浴条件下的庆大霉素衍逡逑生化反应产物的吸光度（见表１），，结果温度在３０°Ｃ？５ＣＴＣ的范围内，温度升高，产物的逡逑吸光度值增大，当温度达到５０°Ｃ及以上时，庆大霉素与水杨醛反应完全，产物的吸光度达逡逑到最大值。因此，最佳反应温度可选择为５０°Ｃ。逡逑３．１．３酸度的选择逡逑在４００ｎｍ波长处分别检测ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０酸度条件下的庆大霉素衍生逡逑化反应产物的吸光度（见表１邋），结果酸度在ｐＨ４．０时，庆大霉素与水杨醛几乎不发生反应；逡逑酸度在ｐＨ５．０时
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.32;R927.2

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