Jaspine B衍生物ZE-2抑制胃癌细胞增殖作用机制的研究

发布时间：2020-05-31 15:07

【摘要】：Jaspine B是从海洋生物海绵中分离出来的天然化合物,并且对多种癌细胞具有良好的抗肿瘤活性。由于Jaspine B结构的特殊性,许多Jaspine B衍生物被合成进行研究,并且发现针对部分癌细胞具有明显的活性,能够限制癌细胞的增殖生长,但是其抗癌机制探索不够深入,而且针对胃癌细胞内部信号通路研究比较少见。在本课题中,Jaspine B衍生物ZE-2化合物对胃癌细胞表现出明显的生长抑制作用,主要探究本化合物怎样抑制胃癌细胞增殖和其诱导胃癌细胞死亡的信号传导过程。其结果如下:1.MTT实验检测到ZE-2抑制了胃癌细胞(MGC803、HGC27和SGC7901)的生长,其中抑制MGC803增殖现象最明显,并且对正常的人胃上皮细胞GES-1没有明显的毒性。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术结果显示,ZE-2诱导胃癌细胞发生细胞凋亡,并且蛋白质免疫印迹实验检测到促进凋亡执行的蛋白表达被上调。2.用JC-1荧光探针检测到ZE-2导致胃癌细胞(MGC803和HGC27)线粒体膜电位降低,蛋白质免疫印迹实验检测到促凋亡蛋白Bax的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达降低,表明ZE-2通过线粒体内部途径诱导细胞凋亡。3.用倒置显微镜观察ZE-2(2μM)处理MGC803 24 h细胞形态变化,发现细胞表面出现空泡化,具有丰富的小囊泡结构。蛋白质免疫印迹实验检测到自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1、Atg3与Atg12的表达增加,表明ZE-2诱导了自噬。蛋白质免疫印迹实验检测到MAPK途径中的JNK和ERK蛋白被磷酸化,以及JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂SCH772984可以逆转ZE-2诱导的LC3-II蛋白质表达。蛋白质免疫共沉淀实验结果显示ZE-2可以使Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL蛋白复合物发生解离以及SP600125和SCH772984可抑制Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL复合体解离,以上结果表明ZE-2是通过JNK/ERK-Bcl-2/Beclin-1/Bcl-xL级联反应诱导自噬。4.蛋白质免疫印迹实验检测到P62随着ZE-2作用时间的延长不断增加,由于P62结构的特殊性,P62可与各种结合配体相互作用,并作为各种细胞信号转导级联的信号传导中枢。蛋白质免疫共沉淀检测到当ZE-2(4μM)与MGC803共同孵育6 h时,P62与Keap1蛋白结合,Nrf2信号下游蛋白HO-1和NQO1都明显增加,核质分离实验显示随着时间的增加Nrf2在细胞核中的表达量逐渐增加,并且在6 h达到最高值,然而其在细胞质中的表达量逐渐降低,Nrf2染色免疫荧光实验显示了Nrf2集中分布在细胞核中,以上结果表明ZE-2在诱导胃癌细胞死亡过程中激活了Nrf2保护机制。5.探索P62-Nrf2途径与凋亡之间的关系。蛋白质免疫共沉淀结果显示JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂SCH772984可以降低由ZE-2诱导的P62与Keap1蛋白的结合,并且可以下调P62以及Nrf2下游蛋白HO-1和NQO1的表达,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术显示SP600125和SCH772984增加了ZE-2诱导的细胞凋亡;蛋白质免疫共沉淀结果显示自噬早期抑制剂LY294002降低了P62和HO-1的表达,MTT显示LY294002降低了ZE-2诱导的细胞存活率,Beclin-1~(-/-)细胞株更加敏感,以及P62 siRNA可以进一步增强ZE-2所诱导的细胞死亡;蛋白质免疫共沉淀结果显示自噬晚期抑制剂BafA1使P62与Keap1蛋白结合程度增加,MTT实验结果显示BafA1可以限制ZE-2所诱导的细胞死亡。以上数据表明JNK/ERK诱导自噬的产生,可以使P62表达量增加后激活Nrf2信号通路,在一定程度上抑制细胞凋亡的发生。综上所述,ZE-2通过线粒体内部途径诱导了胃癌细胞凋亡性死亡,同时通过JNK/ERK途径诱导了胃癌细胞产生自噬现象,使P62蛋白表达量增加,进一步激活Nrf2信号通路抵御ZE-2所诱导的凋亡,但随着时间的延长或者ZE-2浓度的增加,细胞凋亡程度不断增强,胃癌细胞发生凋亡性死亡从而限制细胞的生存。
【图文】：

用现在已被人们探索，并且发现作用，，但是其抗癌机制研究不够较少见。本课题以胃癌细胞系为合成了目标化合物 ZE-2（图 1.2）染法、免疫荧光法、流式细胞术及从细胞及分子方面，探索 ZE-2 对阐明其抗胃癌细胞作用机理，期的潜在药物。图 1.1 Jaspine B 的结构

JaspineB的结构
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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