M1巨噬细胞来源的外泌体通过调节局部炎性微环境增强紫杉醇的抗肿瘤作用

发布时间：2020-06-04 00:32

【摘要】：外泌体(exosomes,Exos)是细胞分泌囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一个亚群,广泛存在于体液和细胞中,具有很多亲本细胞的特性,用于细胞间的通信和信号调节。最近,Exos在天然治疗平台和药物递送系统中受到越来越多的关注,并且很多研究已经证明Exos作为药物递送系统的可行性。目的:该研究关注经典活化的巨噬细胞分泌(M1-mcarophages,M1)的M1-Exos,探讨其激活巨噬细胞(macrophages)的NF-κB信号通路,促进巨噬细胞释放炎性细胞因子,是否可以增强化疗药物的抗肿瘤活性。方法:(1)超高速离心法提取巨噬细胞来源的Exos;透射电镜观察(TEM)Exos形态;动态光散射(DLS)和纳米粒子示踪技术(NTA)检测Exos电位和粒径分布;Western Blot法检测Exos蛋白标志物;采用激光共聚显微镜观察小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)对Exos摄取;流式细胞仪检测摄取率。(2)建立巨噬细胞/4T1共培养体系,验证M1-Exos和M2-Exos的抗肿瘤作用;采用RT-PCR法检测NF-κB、i-κB、iNOS、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-4及IL-10的相对表达量;采用Elisa法检测IL-4、IL-12及TNF-α的含量;采用Caspase-3试剂盒检测肿瘤细胞中Caspase-3的活性。(3)超声法构建M1-Exos载紫杉醇(PTX-M1-Exos)药物递送体系;HPLC法测定紫杉醇的包载量,并对其形态、粒径、Zeta电位进行表征。(4)体外选用小鼠4T1细胞为研究对象,通过MTT实验、流式细胞术进行了体外抗肿瘤研究;体内药效实验选用4T1荷瘤小鼠模型为研究对象,通过Western Blot,TUNEL,HE等实验进行药效评估。结果:(1)经典的超高速离心法从不同巨噬细胞的培养基中,提取分离出不同类型的Exos。透射电镜结果显示提取物的直径范围30-150 nm之间,具有明显的茶托样双膜结构,有的单个分布,有的聚集成群,背景较为清晰,污染物少。DLS和NTA实验结果表明提取物的粒径在200 nm以下。Western Blot检测结果显示,Exos特异性蛋白TSG101,CD63及Alix在Exos中均有表达。通过以上实验结果表明超高速离心法得到的沉淀物即为Exos。此外摄取实验显示,提取出的Exos可以被小鼠肿瘤细胞4T1摄取。(2)巨噬细胞/4T1共培养体系中,M1-Exos可以激活巨噬细胞的NF-κB通路,使得巨噬细胞向M1型极化,释放大量的炎性细胞因子(IL-6,IL-12和TNF-α)。同时对Caspase-3的检测结果发现,M1-Exos给药组肿瘤细胞的Caspase-3活性明显增加,提示M1-Exos可以诱导肿瘤细胞的凋亡。(3)制备的PTX-M1-Exos载药体系从外观形态上看,PTX-M1-Exos载药体系和单独的M1-Exos一样,呈类球状有明显的茶托样双层膜结构,平均粒径130.9 nm和M1-Exos(78.4 nm)相比略微增加,平均电位分别为-17.5 mV和-13.7mV,超声处理后sonicated-M1-Exos的形态,粒径和电位均没有明显的改变。(4)PTX-M1-Exos的体内外药效学研究结果表明,空白的M1-Exos(浓度40μg/mL)体外单独对肿瘤细胞基本无毒副作用,而PTX-M1-Exos可以更好的抑制肿瘤细胞的生长。而体内实验中,单独的M1-Exos组也表现出抑制肿瘤生长的趋势,M1-Exos作为载体本身并不能杀伤肿瘤细胞,但是可以通过激活体内的免疫细胞而发挥间接的抗肿瘤作用。结论:在这项研究中,我们成功构建了Exos载紫杉醇的药物递送系统,将紫杉醇递送至4T1肿瘤细胞中。其中,体内外药效实验实验表明,Exos递送系统不仅增加了PTX的水溶性和抗肿瘤作用,而且还降低了紫杉醇的毒副作用。总之,该课题的思路为Exos作为载体应用于临床提供了一定的理论基础。
【图文】：

细胞 4T1 接种至 6 孔板（每孔大约 106个细胞养基，PBS 清洗两遍，每孔加入 Exo-free 培养 μg/mL），另设置空白对照组。继续培养 12 h ，1500 rpm 离心 5 min，，弃去上清。2 mL 预冷 min，重复两次，弃去 PBS。流式细胞仪测定olt 法检测 M1 和 M2 巨噬细胞标志性蛋t 法检测 M1 和 M2 巨噬细胞标志性蛋白的表1 巨噬细胞的标志性蛋白 iNOS 的表达上调；蛋白 Arg-1 表达丰度增加。

图 2 DLS 检测 M1-Exos 和 M2-Exos 的粒径Fig.2 The size distribution M1-Exos and M2-Exos were measured using dynamic light scattering3.3 NTA 分析外泌体的粒径及颗粒数NTA 分别检测 M1-Exos 和 M2-Exos 的粒径和颗粒数，结果如图 3，粒子的平均密度集中在 120 nm，说明样品粒径较集中，以 160 nm 为 Exos 和其他囊泡的分界线，计算所提取的 Exos 的颗粒数占总颗粒数均在 85%以上。Exos 沉淀经PBS 稀释 7500 倍后，上机检测的浓度为 1~5×107/mL，图 3 右侧图是 Exos 在布朗运动下呈现的白色亮点。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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