黄酮类TMEM16A抑制剂的发现及分子药理学研究

发布时间：2020-06-08 13:20

【摘要】：钙激活氯离子通道是哺乳动物细胞中广泛表达的阴离子通道蛋白,在跨上皮转运、平滑肌收缩、受精、嗅觉传导、神经元兴奋和心脏动作电位复极化等多方面具有重要的生理功能。TMEM16A是第一个被确认的CaCC,其表达于血管平滑肌细胞、呼吸道和消化道上皮细胞、肠道间质Cajal细胞(interstitial cells of cajal,ICC)、感觉神经元和多种肿瘤细胞。选择性调节剂是研究离子通道重要的药理工具,目前已发现了一些CaCCs选择性调节剂(包括抑制剂和激活剂),但是由于选择性低、化学性质不稳定和体内活性较差等原因,都不完全满足CaCCs体内功能研究的需要。本研究利用功能荧光测定细胞模型(FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L)从天然小分子中筛选对TMEM16A氯离子通道具有抑制活性的化合物,利用荧光淬灭实验和短路电流实验分析活性化合物的基本分子药理学性质,利用小鼠结肠离体组织短路电流实验、小鼠肠道平滑肌收缩实验、小鼠胃肠蠕动实验以及大鼠血管环张力测定实验对化合物进行体内外活性分析。实验结果:1.利用FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152L测定模型筛选得到四种黄酮类TMEM16A氯离子通道抑制剂,分别为杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素,IC_(50)值约为98.83μM、40.87μM、49.63μM、44.8μM。2.在FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L上进行的短路电流测定结果显示杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素均能以剂量依赖的方式抑制TMEM16A介导的氯离子电流,最大抑制效率分别为90%、73.9%、76.2%和91.3%,IC_(50)值分别约为49.7μM、20.83μM、24.5μM、27.3μM和20.1μM。3.在FRT-CFTR-YFP-H148Q/I152L上进行荧光淬灭测定显示杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素对CFTR介导的Cl~-电流具有激活作用,EC_(50)值分别为95.06μM、13.24μM、87.36μM、50.47μM。短路电流测定分析显示低浓度(2~50μM)时杜鹃素和黄芩素对CFTR介导的Cl~-电流的激活作用,而高浓度(100~200μM)时杜鹃素和黄芩素对CFTR介导的Cl~-电流具有抑制作用,异鼠李素和石吊兰素对CFTR介导的氯离子电流具有抑制作用。在T84细胞上,杜鹃素和石吊兰素与在FRT-CFTR细胞上结果相同。低浓度(2~50μM)时杜鹃素对CFTR介导的Cl~-电流的激活作用,而高浓度(100~200μM)时杜鹃素对CFTR介导的Cl~-电流具有抑制作用,石吊兰素对CFTR介导的氯离子电流具有激活作用,异鼠李素(50~200μM)对CFTR介导的Cl~-电流具有抑制作用。小鼠结肠粘膜短路电流结果显示杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素对小鼠结肠粘膜上皮CFTR介导的氯离子电流没有作用。4.在HT-29细胞上进行荧光测定显示异鼠李素和高浓度的杜鹃素对CaCC介导的Cl~-电流具有抑制作用,IC_(50)值分别为29.57μM、58.67μM。石吊兰素和黄芩素对CaCC介导的Cl~-电流具有激活作用,EC_(50)值分别为40.57μM、50.16μM。在HT-29和T84细胞上进行的短路电流实验分析显示杜鹃素在低浓度(2~20μM)时对CaCCs氯离子通道表现为激活作用,而高浓度(50~200μM)表现为抑制作用;异鼠李素在10~200μM浓度范围内表现为抑制作用,石吊兰素和黄芩素在5~200μM浓度范围内表现为激活作用。5.选择性分析结果显示上述四种黄酮类化合物在10~200μM范围内对小鼠结肠浆膜侧Na~+-K~+-ATPase没有抑制作用,但是对K~+通道有显著抑制作用,抑制率分别为61.2%、54.3%、57.6%、82.1%。6.小鼠结肠粘膜短路电流结果显示,100μM和200μM的杜鹃素能够抑制小鼠结肠粘膜上皮由卡巴胆碱(CCh)激起的氯离子电流,分别抑制了8.7%和24.8%的电流,100μM和200μM的异鼠李素分别抑制了32.2%和48.9%的电流,100μM和200μM的石吊兰素抑制了非常小的电流,100μM和200μM的黄芩素分别抑制了6%和21.7%的电流。7.小鼠全肠转运时间实验结果显示上述黄酮类化合物均能延长小鼠全肠转运时间,与对照组相比分别延长70%、65.6%、56.4%、64.5%。8.小鼠肠道平滑肌收缩实验结果显示100μM杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素均显著降低了平滑肌收缩频率,抑制收缩强度。9.大鼠血管环实验结果显示异鼠李素(50~300μM)能抑制由去甲肾上腺素(PE)引起血管平滑肌收缩增强。10.肿瘤细胞活力、迁移实验结果显示杜鹃素(1.5625~200μM)在SW620、NCM460细胞上均能抑制细胞活力。杜鹃素(200μM)对NCM460抑制效果最好,在50μM时对SW620抑制效果最好。异鼠李素(12.5μM)对NCM460抑制效果最好,在3.125μM时对SW620抑制效果最好。杜鹃素、异鼠李素均能抑制SW620细胞迁移。结论:本研究发现了杜鹃素、异鼠李素、石吊兰素、黄芩素四种黄酮类化合物能够显著抑制TMEM16A氯离子通道活性,对于进一步揭示黄酮类化合物生理药理学活性奠定了基础,为哮喘、肺动脉高血压、肿瘤、慢传输型便秘等相关疾病的药物治疗提供新的策略和先导化合物。
【图文】：

TMEM16A结构

液体吸收,肠道,肠蠕动,抑制剂

TMEM16A 在 ICC 中高表达，参与肠动力调控，，因此 TMEM16A 抑制剂可能通过减弱肠蠕动而治疗腹泻。图1.2 肠道液体吸收与分泌机制Fig. 1.2 Intestinal fluid transporting mechanisms
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91;R96

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