uPAR靶向性超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备及其在动脉粥样硬化斑块和乳腺癌检测中的应用

发布时间：2020-06-30 22:05

【摘要】：目的:随着医学影像学的发展,越来越多的成像技术被应用到疾病的检测和诊断中。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)技术是一种安全、非侵入性的诊断方法,以其明显的优势广泛应用于肿瘤等多种疾病的成像中,并得到了越来越多的认可。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIO)是一种有效的MRI对比剂,尤其是SPIO具有较大的比表面积,可通过化学偶联等手段导入不同的靶向配体,有助于实现疾病的靶向诊断,提高微小病灶的检出率。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)仍然是威胁人类身体健康的主要因素之一,其致残率和致死率位居世界各大疾病的榜首。AS斑块的破裂往往伴随着血栓的形成,会导致诸多严重后果,如中风和急性冠状动脉综合征等。因此,亟需在斑块破裂之前对斑块作出诊断和评估,进而为治疗策略的制定和实施提供依据。另一方面,乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,是一种高复发性疾病,通常很难治愈。晚期乳腺癌患者通常会出现全身性转移,这与其较高的死亡率密切相关。开发特异性靶向分子影像学对比剂,实现对原发性和继发性的微小乳腺癌病灶的早期诊断,有利于克服在乳腺癌治疗过程中所遇到的高复发率及侵袭转移等难题,并对提高患者的生存率具有重要的意义。尿激酶受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)是一种膜锚定糖蛋白,其天然配体是尿激酶(urokinase-type plasminogen activator,uPA)。uPA通过其氨基末端片段(amino-terminal fragment,ATF)与uPAR结合。有研究表明,uPAR在AS破裂斑块中的表达显著高于非破裂斑块,且大多集中于斑块内巨噬细胞丰富的区域。因此,uPAR可作为一个靶向生物标记,用以评价AS斑块的破裂风险,而到目前为止,关于uPAR靶向的MRI对比剂在AS诊断中的应用尚未见报道。另外,uPAR在正常组织中通常低表达,而在大多数肿瘤组织中高表达,而且不仅肿瘤细胞高表达uPAR,肿瘤微环境中的肿瘤相关细胞也高表达uPAR,因此,以uPAR为靶点的对比剂在肿瘤的早期诊断中具有重大的潜在应用价值。因此,在本研究中,我们拟构建一种靶向uPAR的MRI对比剂,一方面期望其能够对AS斑块中的巨噬细胞进行非侵入性成像,实现AS的靶向诊断,另一方面以小鼠乳腺癌细胞系4T1为细胞模型,对该MRI对比剂的肿瘤靶向性进行评价,最终期望其能够提高乳腺癌微小病灶的早期MRI检出率。方法:首先,通过化学偶联的方式将次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid,NTA)连接到SPIO表面,从而获得了一种通用的磁共振成像探针(SPIO-NTA)。然后将ATF通过组氨酸标签(histidine tags,His tags)偶联到SPIO-NTA上,从而获得了一种具有uPAR靶向性的MRI探针(SPIO-ATF)。通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察SPIOγ-Fe2O3核心的颗粒形貌,通过邻二氮菲法测定SPIO的铁含量,通过质量法测定SPIO的糖含量。通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)分析SPIO、SPIO-ATF的平均水合粒径和表面电位,通过蛋白凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及BCA蛋白定量试剂盒对ATF的导入进行定性与定量分析,通过免疫共沉淀及western blot分析SPIO-ATF与uPAR蛋白的结合能力。以Raw 264.7细胞系、4T1细胞系为细胞模型,对SPIO-ATF的细胞结合能力、细胞摄取情况、以及细胞毒性进行评价。其中,通过普鲁士蓝染色、邻二氮菲法及western blot分析SPIO-ATF的细胞结合能力,利用普鲁士蓝染色和邻二氮菲法分析细胞对SPIO-ATF的摄取情况,采用CCK-8试剂盒测定其细胞毒性。在体内实验中,利用载脂蛋白E基因缺陷(apolipoproteinEdeficient,ApoE-/-)小鼠建立AS模型,并通过油红O染色、马松染色、茜素红染色验证模型的建立及斑块的形成。尾静脉注射SPIO及SPIO-ATF 24 h后,采用7.0 TMRI系统对小鼠腹主动脉进行扫描成像。通过普鲁士蓝染色及免疫组化染色检测SPIO-ATF、uPAR及巨噬细胞在斑块中的分布。最后通过普鲁士蓝染色检测SPIO-ATF在小鼠各脏器中的分布。结果:TEM结果显示SPIO γ-Fe203核心的直径小于10 nm,铁含量为24.67 ± 0.37 mg/mL,糖含量为98.73±2.83 mg/mL。DLS测得SPIO的平均水合粒径为67.13±1.43 nm,偶联ATF后增加为76.59 ± 1.67 nm。SPIO和SPIO-ATF的表面电位分别为-37.13 ±2.54 mV和-13.00 ± 1.55 mV,表面电位的降低可能是由ATF的电荷屏蔽效应导致的。蛋白凝胶电泳及考马斯亮蓝染色结果进一步证实ATF偶联到了 SPIO上。通过BCA蛋白定量试剂盒测定ATF的导入率,结果表明在SPIO-ATF中,葡聚糖、Fe2O3、ATF的摩尔比为4:250:9,即每个葡聚糖分子偶联2-3个ATF多肽分子。免疫共沉淀及western blot分析结果表明SPIO-ATF可以通过ATF与膜蛋白提取液中的uPAR结合,具有靶向uPAR的能力。细胞实验中,普鲁士蓝染色及邻二氮菲法测定铁含量结果显示,当孵育时间为4 h时,SPIO-ATF可与Raw 264.7细胞结合而SPIO不能,且ATF预处理可以显著抑制SPIO-ATF与细胞的结合。Raw 264.7细胞经过佛波酯(phorbol ester,PMA)上调其uPAR表达量或经过SB203580下调其uPAR表达量后,再次与SPIO-ATF孵育,结果显示细胞结合的SPIO-ATF量与uPAR的表达量正相关,表明SPIO-ATF对Raw 264.7细胞具有良好的特异性结合能力,而这种结合是通过ATF与uPAR的相互作用介导的。当孵育时间为24 h时,Raw 264.7细胞对SPIO-ATF的摄取具有浓度依赖性。CCK-8检测结果显示在实验条件下,SPIO与SPIO-ATF都没有表现出明显的细胞毒性。作为高表达uPAR的细胞,4T1同样可以被SPIO-ATF特异性结合,此外4T1细胞对SPIO-ATF的摄取也具有浓度依赖性。动物实验中,经过3个月高脂喂养,ApoE-/-、鼠主动脉树的大体油红O染色结果显示,主动脉壁上已经形成了多个AS斑块。腹主动脉冰冻切片的油红O染色结果显示斑块内含有大量脂质。马松染色结果表明AS斑块内含有大量胶原纤维,表明平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)由动脉中膜迁移到动脉内膜,并进行大量增殖。茜素红染色结果显示AS斑块内出现了钙化结节,表明斑块处于较晚期阶段。以上结果证明小鼠AS模型已成功建立。通过小鼠尾静脉分别注射SPIO或SPIO-ATF 24 h后,体内MRI扫描结果表明,SPIO-ATF可将腹主动脉血管壁T2信号强度降低53.2%,显著增强斑块区域的显影效果,而SPIO可降低26.5%,二者之间的差异具有显著性,SPIO-ATF展现出了良好的增强显影效果的能力。此外,斑块组织的普鲁士蓝染色结果显示,与SPIO组相比,SPIO-ATF组AS斑块内出现大量蓝染氧化铁纳米颗粒,表明ATF的修饰可以显著增加SPIO-ATF在斑块中的聚集。uPAR、CD68的免疫组化结果显示,uPAR与巨噬细胞在斑块中出现共定位,表明巨噬细胞是斑块中表达uPAR的主要细胞。同时SPIO-ATF与巨噬细胞也出现共定位,表明SPIO-ATF具有靶向斑块内巨噬细胞的能力。它可以通过ATF与uPAR的相互作用而被巨噬细胞摄取,从而增加SPIO-ATF在斑块中的聚集,增强其对斑块的显影效果。体内分布实验结果显示,SPIO与SPIO-ATF主要集中在肝脏和脾脏中,而在心脏、肺脏、肾脏及脑组织中未观察到明显蓝染氧化铁纳米颗粒,表明SPIO与SPIO-ATF主要被网状内皮系统截留。另外,肝脏和脾脏中SPIO-ATF的分布比SPIO少,提示ATF的导入可能部分程度减少了网状内皮系统对SPIO-ATF的非特异性截留,SPIO-ATF可能通过靶向作用更多地聚集在了 AS斑块中。结论:综上,本研究构建了一种新型MRI对比剂——SPIO-ATF。一方面,通过ATF与uPAR的相互作用,SPIO-ATF展现出了良好的巨噬细胞靶向能力。经尾静脉注射到AS小鼠模型体内后,SPIO-ATF可以积累在AS斑块中巨噬细胞丰富的区域,显著降低腹主动脉血管壁T2信号强度,进而增强斑块区域的显影效果,在易损斑块的诊断和治疗中展现出巨大的潜在应用价值。另一方面,SPIO-ATF可以特异性结合乳腺癌细胞系4T1并被其摄取,具有良好的特异性靶向能力,从而有望实现对乳腺癌的靶向诊断,为乳腺癌微小病灶的早期MRI诊断提供了一种新策略。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R981
【图文】：

超速离心,溶液,探针,表面活化

用５邋ｍＬ磷酸钠缓冲液（０．１邋Ｍ，ｐＨ邋７．５）溶解７５．３邋ｍｇ邋Ａ－ＮＴＡ后将其加入上述逡逑反应溶液中，在磁力搅拌下室温反应２ｈ，使ＳＰＩＯ表面活化的羧基与Ａ－ＮＴＡ的氨逡逑基进行反应，从而获得一种通用的ＭＲ成像探针——ＳＰＩＯ－ＮＴＡ邋（图１）。反应溶液逡逑经过５００００邋ｒｐｍ超速离心２ｈ后，收集沉淀，得到ＳＰＩＯ－ＮＴＡ。逡逑％邋凄逡逑。逦＜邋＞逦。逦＼邋４＇邋，灔逡逑？邋二S谩桃诲义蟺r邋ＥＤＣ／Ｓｕ丨娝Ｓ逦，逦Ｎｉ－逡逑０邋％逡逑ＳＰＩＯ逦ＳＰＩＯ－ＮＴＡ逦ＳＰＩＯ－ＡＴＦ逡逑ａｎ邋ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｐｌａｔｆｏｒｍ逡逑图１邋ＳＰＩＯ－ＡＴＦ的制备。通过ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ反应将Ａ－ＮＴＡ连接到ＳＰＩＯ表面葡聚逡逑糖的竣基上，获得一种通用的磁共振成像探针ＳＰＩＯ－ＮＴＡ。在Ｎｉ２＋的存在下，通过逡逑ＡＴＦ上Ｈｉｓ邋ｔａｇｓ与ＮＴＡ之间的配位作用将ＡＴＦ偶联到ＳＰＩＯ－ＮＴＡ上，获得ｕＰＡＲ靶逡逑向的ＭＲＩ对比剂ＳＰＩＯ－ＡＴＦ。逡逑将ＳＰＩＯ－ＮＴＡ用１０邋ｍＬ双蒸水重悬，再加入６８．２邋ｇ邋ＮｉＣｌ２邋？邋６Ｈ２Ｏ，室温条件下逡逑磁力揽拌３０邋ｍｉｎ，使Ｎｉ２＋与ＮＴＡ形成４个配位键。将反应溶液在５００００邋ｒｐｍ条件下逡逑超速离心２邋ｈ后

通过类似免疫共沉淀的方法及ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ对ＳＰＩＯ－ＡＴＦ与ｕＰＡＲ的亲合力进行逡逑评价。＼￥６５丨６１１＾１0１结果显示，在１１？八１＾分子量处，与８？１０－八丁？结合的膜蛋白组出逡逑现明显蛋白条带（图２Ｃ，第一条泳道），而与ＳＰＩＯ结合的膜蛋白组则没有观察到逡逑明显蛋白条带（图２Ｃ，第三条泳道），这表明ＳＰＩＯ－ＡＴＦ可以通过ＡＴＦ与ｕＰＡＲ结逡逑合，具有靶向ＵＰＡＲ的能力，为之后的细胞实验、动物实验提供了依据。逡逑表７邋ＳＰＩＯ与ＳＰＩＯ－ＡＴＦ的理化学性质逡逑ＳＰＩＯ逦ＳＰＩＯ－ＡＴＦ逡逑ａｖｅｒａｇｅ邋ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋（ｎｍ）逦６７．１３＋邋１．４３逦７６．５９＋１．６７逡逑Ｚｅｔａ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋（ｍＶ）逦－３７．１３±２．５４逦－１３．００±１．５５逡逑ｍｏｌａｒ邋ｒａｔｉｏ邋（ｄｅｘｔｉａｎ：Ｆｅ２０３：ＡＴＦ）逦Ｎ／Ａ逦４：２５０：９逡逑Ａ逦Ｂ邋Ｍａｒｋｅｒ邋—逦—逡逑Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ邋Ｆｒｅｅ逡逑〔＿邋——丨一．逡逑一—：二」逡逑ＳＰＩＯ－ＡＴＦ邋ＳＰＩＯ逡逑Ｂｏｕｎｄ邋Ｕｎｂｏｕｎｄ邋Ｂｏｕｎｄ邋Ｕｎｂｏｕｎｄ逡逑ｕＰＡＲｉ＾ｒ＾ｒｒ邋￣ｊｍｒｎ逡逑图２邋ＳＰＩＯ－ＡＴＦ的理化学表征。（Ａ）邋ＳＰＩＯ的透射电子显微镜照片（比例尺：２０邋ｎｍ）。逡逑（Ｂ）通过蛋白凝胶电泳及考马斯亮蓝染色检测与ＳＰＩＯ结合的ＡＴＦ。（Ｃ）通过逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测与ＳＰＩＯ－ＡＴＦ或ＳＰＩＯ结合的ｕＰＡＲ蛋白及上清中未结合的ｕＰＡＲ蛋逡逑白。逡逑３０逡逑

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