纹党多糖硒化物的制备、结构表征及其抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-03-29 07:06

  本文关键词：纹党多糖硒化物的制备、结构表征及其抗肿瘤活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：有机硒化合物因生物活性强,毒性低,已成为近年来研究的重点。硒多糖作为一种有机硒化合物,其药理活性普遍高于多糖和硒,且易被机体吸收。纹党多糖是纹党(素花党参(Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta (Nannf.) L.T.Shen))的重要活性成分,具有抗癌活性。为了制备出硒补充剂及活性更强的抗癌剂,本文首先以纹党参多糖(Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-CPP1)为原料,采用HNO3-Na2SeO3方法,制备硒化纹党多糖(selenized-Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-sCPP1),以单因素结合正交实验优化硒化工艺；其次对从W-CPP1分离得到的均一性果胶多糖(W-CPPlb)进行了硒化修饰,并对制备的W-CPPlb硒化物(W-sCPP1b)进行了结构表征及抗肿瘤活性研究。本论文具体包括如下内容：1、硒化纹党多糖W-sCPP1的制备及抗肿瘤活性研究(1)细胞毒活性筛选：将实验室预先得到的纹党多糖不同比例醇沉部分W-CPP1, W-CPP2, W-CPP3, W-CPP4进行抗肿瘤活性筛选。结果发现,4个级分在400 μg/mL时对A549,BGC-823和HeLa细胞的抑制率分别为47.7%,38%,31.7%; 23.0%,26.9%,5.01%; 20.5%,23%,20.9%; 21.8%,20%,17.2%。 W-CPP1对三种肿瘤细胞的生长抑制作用均强于其他三种。因此W-CPP1被选择用于硒化研究。(2)硒化W-CPP1 (selenized-Wen Codonopsis pilosula polysaccharides, W-sCPP1)的制备：采用HN03-Na2Se03方法,结合单因素和正交实验研究W-sCPP1制备工艺,以硒含量,硒化产率,对A549细胞的抑制率为考察指标。所获得的最佳工艺为：W-CPP1与亚硒酸钠比例1:1, 100mgW-CPP1反应体系中氯化钡使用量0.1g,反应温度60-C,反应时间5h, HNO3百分含量为1.0%。W-sCPP1的抗肿瘤活性和硒含量具有正相关(相关系数r=0.67),且W-sCPP1的抗肿瘤活性显著高于W-CPP1。2、硒化纹党果胶多糖(W-CPPlb)的制备、结构表征及抗肿瘤活性研究(1) W-CPPlb的制备及其抗肿瘤活性研究：经DEAE-52纤维素柱分离纯化W-CPP1,不同浓度NaCl洗脱得到三个均一性多糖,命名为W-CPP1a, W-CPP1b, W-CPPlc。以MTT法筛选发现,W-CPP1a, W-CPP1b, W-CPP1c在400μg/mL时对A549, BGC-823, HeLa细胞的抑制率分别为43.2%,20.96%,23.09%；55.8%,48.84%,45.13%：26.87%,11.97%,15.23%。W-CPP1b对三种肿瘤细胞的生长抑制作用均强于W-CPP1a, W-CPP1c。(2) W-sCPP1b的制备：在参考合成W-sCPP1的最佳单因素基础上,以正交设计优化W-sCPP1b的制备条件,采用HNO3-Na2SeO3方法合成W-sCPP1b,优化得到的最佳硒化条件和W-sCPP1的制备条件一致。在最佳制备条件下,制备的W-sCPP1b硒含量为0.48mg/g,产率为86%。(3) W-sCPP1b的结构表征：红外光谱法表征发现W-sCPP1b中Se是以的形式存在；热重分析表明硒化反应改变了纹党多糖的热稳定性；高效凝胶渗透色谱结果显示W-sCPP1b与W-CPP1b为均一性多糖,W-sCPP1b的分子构型为无规则线团。间羟基联苯法结果显示硒化前后糖醛酸含量一致。基于和W-CPP1b的结构进行比较,推测W-sCPP1b的结构为：3、W-CPP1b和W-sCPP1b的抗肿瘤机制研究采用瑞氏染色法,划痕法,Annexin-V-FITC/PI检测试剂盒以及Western blot分别研究了W-sCPP1b和W-CPP1b对人肺癌细胞A549的形态,细胞迁移,细胞周期,细胞凋亡以及对凋亡相关蛋白表达的影响。研究发现W-sCPP1b和W-CPP1b能够改变A549细胞形态学；阻滞A549细胞迁移；引起的A549细胞凋亡峰面积分别为11.65%和3.08%,G2/M期DNA含量分别为为44.02%和29.81%-在200μg/mL 下 W-sCPP1b和W-CPP1b引起的细胞凋亡率为11.01%和8.14%。W-sCPP1b和W-CPP1b可上调A549细胞Bax、caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2蛋白的表达。以上结果表明W-sCPP1b和W-CPP1b可通过阻滞A549细胞迁移,影响细胞周期G2/M的DNA合成、促进肿瘤细胞凋亡、影响凋亡相关蛋白的表达,从而发挥抗肿瘤活性,提示W-sCP1b和W-CPP1b可能是通过线粒体凋亡途径引起A549细胞凋亡。
【关键词】：纹党参多糖 硒化修饰 结构分析 抗肿瘤活性 线粒体凋亡途径
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文对照及英文缩写词表7-15
• 综述15-37
• 1 党参研究现状15-19
• 1.1 党参品系及产地15
• 1.2 党参的主要化学成分15-17
• 1.3 党参多糖的研究17-19
• 1.3.1 党参多糖的分离纯化17-18
• 1.3.2 党参多糖的结构18
• 1.3.3 党参多糖的药理活性18-19
• 1.3.3.1 抗肿瘤18-19
• 1.3.3.2 增强免疫19
• 1.3.3.3 其他活性19
• 2 多糖的结构修饰方法19-21
• 2.1 多糖的硫酸化19-20
• 2.2 多糖的乙酰化20
• 2.3 多糖磷酸酯化20
• 2.4 多糖的硒化20-21
• 3 硒的研究现状21-27
• 3.1 硒的化学形式21
• 3.2 有机硒的研究21-22
• 3.3 含硒生物大分子22-25
• 3.3.1 硒与蛋白22-23
• 3.3.2 硒与核酸23-24
• 3.3.3 硒多糖24-25
• 3.3.3.1 硒多糖的结构24
• 3.3.3.2 硒多糖的药理活性24-25
• 3.4 硒化合物的抗肿瘤作用机制25-27
• 3.4.1 硒化合物的抗氧化作用25-26
• 3.4.2 硒化合物对癌基因表达和细胞凋亡的影响26
• 3.4.3 硒化合物对免疫作用的调节26
• 3.4.4 硒化合物的其它抗癌机制26-27
• 4 细胞凋亡信号传导途径27-28
• 4.1 线粒体途径27
• 4.2 死亡受体途径27-28
• 4.2.1 Fas信号途径27
• 4.2.2 TNF信号途径27-28
• 4.2.3 DR3、DR4、DR5信号途径28
• 4.3 内质网信号途径28
• 5 本论文的选题依据及研究内容28-31
• 参考文献31-37
• 第一章 基于抗肿瘤活性的纹党多糖硒化工艺研究37-47
• 1 引言37
• 2 实验部分37-41
• 2.1 实验材料、试剂和仪器37-38
• 2.1.1 实验材料37-38
• 2.1.2 实验试剂及仪器38
• 2.2 实验方法38-41
• 2.2.1 纹党多糖各级分-W-CPP1、W-CPP2、W-CPP3及W-CPP4的抗肿瘤活性38
• 2.2.2 纹党多糖硒化工艺优化38-39
• 2.2.2.1 单因素试验39
• 2.2.2.2 正交试验39
• 2.2.3 硒含量及抗肿瘤活性的相关性分析39-40
• 2.2.4 硒含量的测定40
• 2.2.5 验证试验40-41
• 3 结果与讨论41-45
• 3.1 纹党多糖各级分-W-CPP1、W-CPP2、W-CPP3及W-CPP4的抗肿瘤活性41
• 3.2 优化硒化工艺41-44
• 3.2.1 硒化纹党多糖的单因素试验41-42
• 3.2.2 硒化纹党多糖的正交设计试验42
• 3.2.3 硒化纹党多糖的方差分析42-44
• 3.3 硒化纹党多糖硒含量和抑制率的相关性44
• 3.4 W-CPP1及W-sCPP1的抗肿瘤活性比较44
• 3.5 验证试验44-45
• 4 小结45-47
• 第二章 纹党果胶多糖-W-CPP1b的硒化工艺及其结构分析47-59
• 1 引言47
• 2 实验部分47-50
• 2.1 实验药材、试剂及仪器47-49
• 2.1.1 实验材料47-48
• 2.1.2 实验试剂及仪器48-49
• 2.2 实验方法49-50
• 2.2.1 W-CPP1各级分-W-CPP1a、W-CPP1b及W-CPP1c抗肿瘤活性比较49
• 2.2.2 正交设计优化硒化纹党果胶多糖49
• 2.2.3 硒化纹党果胶多糖表征49-50
• 2.2.3.1 傅立叶变换红外光谱(FT-IR)49
• 2.2.3.2 热重分析(TG)49
• 2.2.3.3 硒化纹党参果胶多糖-W-sCPP1b分子特性研究49-50
• 2.2.3.4 糖醛酸含量的测定50
• 3 实验结果及讨论50-57
• 3.1 W-CPP1各级分-W-CPP1a、W-CPP1b及W-CPP1c抗肿瘤活性比较50-51
• 3.2 正交设计硒化纹党果胶多糖51-53
• 3.3 验证试验53-54
• 3.4 硒化纹党果胶多糖结构特征54-57
• 3.4.1 FT-IR结果分析54-55
• 3.4.2 热重分析55-56
• 3.4.2 分子量分析56-57
• 3.4.3 糖醛酸含量分析57
• 4 小结57-59
• 第三章 W-CPP1b和W-sCPP1b的抗肿瘤机制研究59-72
• 1 引言59
• 2 实验部分59-61
• 2.1 实验药品及仪器59-60
• 2.1.1 实验药品及试剂59
• 2.1.2 实验仪器59-60
• 2.2 实验方法60-61
• 2.2.1 细胞培养条件60
• 2.2.2 MTT检测60
• 2.2.3 凋亡细胞形态学60
• 2.2.4 细胞迁移检测60
• 2.2.5 细胞周期检测60-61
• 2.2.6 凋亡检测61
• 3 实验结果与讨论61-66
• 3.1 细胞毒性61-62
• 3.2 对细胞形态学的影响62
• 3.3 抑制细胞迁移62-64
• 3.4 阻滞A549细胞周期64
• 3.5 诱导细胞凋亡64-65
• 3.6 蛋白免疫印迹65-66
• 4 小结66-68
• 参考文献68-72
• 第四章 其他研究72-89
• 第一节 纹党醇提物和青娥方各配伍提取物体外抗胆碱酯酶活性研究72-78
• 1 前言72
• 2 实验部分72-74
• 2.1 实验药品及仪器72-73
• 2.2 纹党醇提物和青娥方各配伍醇提物对胆碱酯酶活性的影响73-74
• 2.3 色谱与质谱方法74
• 2.3.1 液相色谱条件74
• 2.3.2 质谱条件74
• 3 实验结果74-77
• 3.1 纹党参醇提物的抗胆碱酯酶活性74-75
• 3.2 青娥方配伍醇提物的抗胆碱酯酶活性75-77
• 4 小结77-78
• 第二节 青娥丸相关活性成分在Caco-2细胞单层膜上的吸收作用研究78-88
• 1 前言78-79
• 2 实验过程79-81
• 2.1 实验仪器及试剂79
• 2.2 储备液的配制79
• 2.3 细胞毒性试验79-80
• 2.4 双向转运实验80
• 2.5 分析方法的建立80-81
• 2.5.1 色谱条件80
• 2.5.2 质谱条件80-81
• 2.6 样品处理81
• 2.7 计算P值81
• 3 实验结果81-87
• 3.1 杜仲活性成分对Caco-2细胞存活率的影响81-82
• 3.2 松脂醇二葡糖苷和绿原酸在Caco-2准运能力的研究82-83
• 3.3 时间对绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷转运的影响83-85
• 3.4 浓度对绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷转运的影响85-87
• 4 小结87-88
• 参考文献88-89
• 第五章 总结89-90
• 在学期间的研究成果90-91
• 致谢91

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