基于AID酶与哺乳动物细胞展示技术的抗PD-1抗体体外进化研究

发布时间：2017-03-29 10:27

  本文关键词：基于AID酶与哺乳动物细胞展示技术的抗PD-1抗体体外进化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:抗体作为一种特异性强、安全性高、效果显著的药物,在肿瘤等多种疾病的临床治疗中发挥重要作用。在多种抗体制备技术中,抗体库技术是最常用的技术之一。活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase AID)参与B细胞受体亲和力成熟,促进并诱导免疫球蛋白可变区的突变,在抗体体内成熟过程中发挥重要作用。文献报道,在抗体库中引入AID酶,有助于提高抗体库库容。因此,AID酶与抗体库技术相结合的抗体筛选技术成为当前抗体筛选的一个研究热点。免疫负调控的共刺激信号通路PD-1/PD-L1在肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要的作用,PD-1、PD-L1并成为肿瘤免疫治疗的新靶点。抗PD-1/PD-L1的抗体药物也成为了新的研究热点。目的:在课题组前期搭建的“哺乳动物细胞展示抗体库技术”基础上,本研究以PD-1为靶点,将抗体库技术与AID酶诱导抗体基因体外进化成熟相结合,借助流式细胞分选技术,探讨了一种高通量的抗体筛选新方法。方法:通过IMGT获得抗PD-1抗体Nivolumab的可变区氨基酸序列,合理考察密码子偏性的前提下进行反向翻译获得可变区基因序列;通过全合成制备Nivolumab的轻重链基因,并克隆入pFRT-IgG1载体中进行表达,全抗体命名为MIL75。将MIL75抗体Fab片段克隆至pFRT-FTMK载体上,该载体在抗体Fab片段的重链C末端偶联了PDGFR-α跨膜区,使抗体Fab片段能够展示在细胞膜上。通过真核细胞转染技术将载体转染到CHO-K1-FRT细胞中并筛选稳定表达细胞株,进一步将含有AID酶基因的载体转染至稳定表达细胞中。利用FITC标记的PD-1抗原(PD-1-FITC),通过流式分选的方法筛选高亲和力的抗体。将富集到的细胞提取基因组,调取抗体基因经测序并克隆到全长抗体表达载体pFRT-IgG1上进行表达。随后对筛选得到的抗体进行了初步功能评价:(1)利用ELISA和Biacore的方法评价了抗体与抗原结合的特异性和亲和力;(2)针对筛选获得的高亲和力抗体,借助混合淋巴细胞反应实验,通过检测T细胞分泌IFN-γ的水平来评价抗体激活T细胞的功能;(3)在免疫缺陷NPG小鼠中输注人PMBC,构建GVHD模型,进一步给予抗PD-1抗体,通过免疫排斥反应的强弱评价抗体体内生物学活性。结果:(1)将全合成的抗体可变区基因分别克隆入载体pFRT-IgG1以及pFRTFTMK中,成功构建MIL75全长抗体表达载体pFRT-IgG1K-MIL75以及Fab抗体细胞膜展示载体pFRT-FTMK-MIL75Fab。pFRT-IgG1K-MIL75稳定转染CHO-K1-FRT细胞后,经过加压筛选,获得了MIL75全长抗体稳定表达细胞株。ELISA结果表明,表达的MIL75抗体可以特异性、高亲和力识别PD-1抗原。pFRT-FTMK-MIL75Fab稳定转染稳定转染CHO-K1-FRT细胞后,经过加压筛选,获得稳定表达MIL75-Fab的细胞株。流式细胞术检测结果显示,MIL75-Fab成功展示在CHO-K1-FRT细胞表面,且能与抗原PD-1的特异性结合并具有浓度依赖性;进一步转染入AID酶诱导突变。(2)经流式筛选及计算机序列比对分析后获得三条新的抗体序列,分别为Fv56、Fv60、Fv70。(3)体外结合实验表明Fv56、Fv60、Fv70三株抗体均能够与靶抗原PD-1特异性结合;其中,Fv56、Fv60识别的表位与MIL75相同;Fv70识别的表位发生了漂移。抗体Fv56、Fv60在体外能够特异性阻断PD-1与PD-L1相互作用。进一步的生物学功能实验表明:Fv56、Fv60与母本抗体MIL75具有相似的生物学活性,均能够激活T细胞,上调T细胞分泌IFN-γ,并具有一定的抗体浓度依赖性;而Fv70只在高浓度下对T细胞具有激活功能。(4)体内生物学功能实验结果显示抗体Fv56能够激活人源化小鼠体内的T细胞,加剧免疫排斥反应,缩短了小鼠的生存时间。结论:本研究将哺乳动物细胞展示技术与AID酶诱导抗体亲和力成熟相结合,建立了一种能够快速有效进行体外抗体进化的筛选技术。并以PD-1为靶点,通过这种方法筛选得到了三株新的抗体Fv56、Fv60和Fv70;其中Fv56、Fv60两株抗体具有良好的T细胞激活功能,其生物学活性与母本抗体MIL75相似。
【关键词】：抗体 哺乳动物细胞展示技术 AID酶 PD-1
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略词表11-13
• 引言13-17
• 第一部分 MIL75FAB在哺乳动物细胞表面展示及母本抗体MIL75表达纯化17-31
• 1.实验目的17
• 2.材料与方法17-21
• 2.1 材料17-18
• 2.2 方法18-21
• 3.结果21-27
• 3.1 MIL75基因合成21-22
• 3.2 pFRT-IgG1K-MIL75和pFRT-FTMK-MIL75Fab表达载体的构建22-23
• 3.3 MIL75的表达23-24
• 3.4 MIL75的纯化及鉴定24-26
• 3.5 MIL75-Fab稳定展示细胞株的流式鉴定26-27
• 3.6 AID酶的表达27
• 4.讨论27-29
• 第一部分 小结29-31
• 第二部分 基于AID酶的抗体筛选31-45
• 1.实验目的31
• 2.材料与方法31-35
• 2.1 材料31-32
• 2.2 方法32-35
• 3.结果35-42
• 3.1 基于AID酶 的MIL75Fab抗体库的鉴定35-36
• 3.2 流式筛选新的抗PD-1 的抗体36-38
• 3.3 序列分析确定了三株新的抗PD-1 的抗体38-39
• 3.4 FV56，FV60，FV70全长表达载体的构建39-40
• 3.5 FV56，，FV60，FV70的瞬时表达40
• 3.6 三株新抗体的表达纯化40-42
• 4.讨论42-43
• 第二部分 小结43-45
• 第三部分 抗体的体内外活性评价45-59
• 1.实验目的45
• 2.材料方法45-49
• 2.1 材料45-46
• 2.2 方法46-49
• 3. 结果49-55
• 3.1 新筛选的抗体能够结合其抗原PD-149
• 3.2 新筛选的抗体不能与CD28家族其他分子结合49-50
• 3.3 新筛选的抗体亲和力的鉴定50-51
• 3.4 FV56、FV60和FV70识别抗原表位的鉴定51-52
• 3.5 FV56、FV60和FV70阻断PD-1/PDL1相互作用52
• 3.6 抗体的体外生物活性52-54
• 3.7 FV56与MIL75的体内生物学活性54-55
• 4.讨论55-57
• 第三部分 小结57-59
• 全文总结59-61
• 参考文献61-63
• 综述63-75
• 参考文献71-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75-76
• 致谢76-77

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本文编号：274281