PARP抑制剂抗肿瘤机制和耐药机制研究

发布时间：2020-07-03 15:11

【摘要】：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂是基于协同致死作用的新型小分子靶向药物。目前已有4个PARP抑制剂先后获批上市,在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等治疗中取得巨大成功,在抗肿瘤领域占有重要地位。然而,PARP抑制剂的抗肿瘤机制尚未完全阐明,如PARP1-DNA捕获理论(PARP1-DNA trapping)存在争议;同时肿瘤对PARP抑制剂将不可避免地产生耐药性,从而导致治疗失败,目前对其耐药特性和机制仍缺乏全面了解。因此,本课题系统地研究了PARP抑制剂的抗肿瘤作用机制,阐明了决定PARP抑制剂药效的关键因素,开发了更有效的高通量分子筛选模型。同时,对BRCA2缺陷胰腺癌Capan-1细胞的PARP抑制剂耐药机制进行了研究,发现了BRCA2内含子新突变和凋亡耐受的耐药新机制,为PARP抑制剂的临床开发与应用、耐药克服和预防提供了新的思路。在抗肿瘤机制研究方面,对决定PARP抑制剂药效的关键因素进行了探索,阐明了细胞杀伤作用、PARP1-DNA捕获强度、酶活抑制能力三者之间的关系。首先,发现了PARP抑制剂的PARP1-DNA捕获强度与其细胞毒性的相关性不强。采取三种不同策略,包括不同PARP抑制剂同一浓度、同一PARP抑制剂不同浓度以及不同PARP抑制剂的IC_(50)条件下,进行PARP1-DNA捕获与细胞毒性的相关性研究,均发现PARP抑制剂的细胞毒性不取决于PARP1-DNA捕获强度。其次,发现PARP抑制剂细胞毒性依赖于细胞内PARP酶活性。我们构建了尤文氏瘤细胞的PARP1敲除株,然后稳定回补野生型PARP1(WT)、酶活缺失型的点突变PARP1(E988K)、以及不同酶活强度的PARP1突变体。在亲本细胞、PARP1敲除细胞以及12株PARP1突变体细胞中,我们对细胞内PARP酶活强度、PARP抑制剂对酶活抑制能力、PARP1-DNA捕获强度与PARP抑制剂细胞毒性的关系进行了系统研究,发现PARP抑制剂的细胞毒性与不同细胞内的PARP酶活相关性最强(r=-0.70;p=0.0052),与PARP1-DNA捕获能力的相关性明显弱于PARP酶活(r=-0.58;p=0.0284),而与酶活抑制能力的相关性最弱(r=-0.13;p=0.72)。此外,PARP1-DNA捕获也与细胞内PARP酶活高度相关(r=0.82;p=0.0003),与酶活抑制能力相关性较低(r=0.35;p=0.33)。经典的基于组蛋白为底物的ELISA模型测得的不同PARP抑制剂抑制PARP1酶活能力与其细胞毒性缺乏相关性(r=0.3898;p=0.4245)。我们构建了两个荧光各向异性(FA)分子模型,并用DNA双链损伤荧光各向异性模型(DSB-FA模型)测试了不同PARP抑制剂抑制PARP1-DNA解离的EC_(50),与17株敏感肿瘤细胞的IC_(50)的均值相关性分析,发现除Niraparib之外,在其他5种PARP抑制剂中两者具有极高的线性相关性(r=0.9984;p0.0001)。我们推测PARP抑制剂通过抑制PARP1的自身PAR化,使之不能从DNA上解离下来,从而增加PARP1-DNA结合能力,与其细胞水平的药效相关性最强,强于PARP1-DNA捕获。最后,我们对两种FA模型以及现有PARP抑制剂分子评价模型进行比较分析,发现DSB-FA模型是一种新型、高效、快速、稳定、低成本、无放射性污染并与细胞水平药效相关性最高的PARP抑制剂分子筛选模型。在耐药特性和机制研究方面,本研究通过浓度递增诱导的方式分别构建了Capan-1对PARP抑制剂Olaparib(OP)、Simmiparib(SP)和Talazoparib(TP)的耐药细胞,分别命名为Capan-1/OP、Capan-1/SP和Capan-1/TP。细胞生物学结果显示耐药细胞株在细胞形态、增殖速度、迁移能力上没有明显或者一致性变化,其恶性程度也没有明显增加。三个耐药细胞株不仅对诱导PARP抑制剂具有不同程度的耐药,而且对其他PARP抑制剂也产生了交叉耐药。我们对耐药机制进行了深入研究,发现耐药细胞中PARP家族成员、多药耐药蛋白P-gp等没有发生明显变化;耐药细胞的BRCA2缺失突变位点c.6174delT也没有出现回复突变或者缺失。全基因测序显示,BRCA2的11号内含子出现新的杂合子突变,这一突变导致了新的具有C末端的BRCA2剪切体形成;然而新C-BRCA2蛋白剪切体仅贡献部分的PARP抑制剂耐药(32.22~49.03%)。我们发现耐药细胞中存在较高的DNA损伤蓄积,且不影响细胞的存活和衰老,提示耐药细胞对DNA损伤蓄积具有一定的耐受。在耐药细胞和亲本细胞中,等效浓度的PARP抑制剂能引起同等程度甚至更高程度的DNA损伤蓄积和细胞周期阻滞,但耐药细胞中的凋亡信号(包括磷脂酰丝氨酸外翻、Caspase3/7/8/9激活和线粒体膜电位下调)显著低于亲本细胞。进一步研究发现,耐药细胞中抗凋亡蛋白COX-2和BIRC3的转录和蛋白表达水平显著高于亲本细胞。干扰COX-2或BIRC3后,耐药细胞对PARP抑制剂的敏感性最高可恢复72.33%和70.31%,同时部分恢复了PARP抑制剂引起的耐药细胞凋亡信号,提示COX-2和BIRC3高表达是PARP抑制剂耐药机制之一。BIRC3抑制剂LCL161与PARP抑制剂联用,能显著恢复耐药细胞对PARP抑制剂的敏感性,为耐药肿瘤的治疗提供了新线索。最后,我们发现PARP抑制剂、PARP1敲除均可以引起COX-2和BIRC3转录水平的显著上调,说明PARP1是COX-2和BIRC3的新型转录负调控因子。综上所述,本研究阐明了PARP抑制剂抗肿瘤药效的关键影响因素是细胞内PARP酶活性;证明了PARP抑制剂抑制DNA上聚合态PAR的形成,从而促进PARP1-DNA结合,与PARP抑制剂的细胞毒性相关性强于PARP1-DNA捕获,并基于此建立了新型高效预测PARP抑制剂细胞毒性的分子水平筛选评价体系。耐药机制研究方面,通过构建了三种不同PARP抑制剂的胰腺癌Capan-1耐药细胞株,阐明了BRCA2内含子11的新突变和COX-2/BIRC3过表达介导的凋亡耐受贡献于PARP抑制剂耐药。以上研究为PARP抑制剂抗肿瘤和耐药机制研究增添了新的内容,对于促进PARP抑制剂的临床开发与应用、耐药性克服具有重要的理论意义和应用价值。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

模型图,催化循环,模型,位点

在 DNA 损伤位点形成空间位阻以及大量的负离子积聚，一方面可NA 损伤位点周围的 DNA 分子与 DNA 损伤位点发生错配重组，另一方阻止 PARP1 与 DNA 损伤位点的进一步结合并最终导致 PARP1/2 从 D下来，从而为 DNA 修复相关蛋白发挥作用提供空间。解离下来的 PARP物在聚腺苷二磷酸核糖水解酶（PARG）作用下被裂解，裂解后的 ADP新用于合成 NAD+，而重新形成单体的 PARP1/2 可被再次激活，如此循 DNA 损伤位点，完成 DNA 损伤修复[2, 8-10]。PARP2 与 PARP1 具有 6源性，其一般通过聚合态 PAR 招募并激活催化分支的 PAR 链合成参与修复[11, 12]。除了 PARP1/2 在 DNA 损伤修复应答中发挥着重要作用外，的其它成员在 DNA 损伤修复、炎症调控、转录调节、信号转导、基因、细胞周期调控以及有丝分裂等一系列广泛的细胞代谢进程中发挥着重 13, 14]。

抑制剂,抗肿瘤作用

图 1.2 PARP 抑制剂抗肿瘤机制1.1.2.3 PARP 抑制剂增加 PARP1-DNA 捕获然而，临床前以及临床研究的多个证据表明，PARP 抑制剂的酶活性抑制能力与其抗肿瘤细胞毒性和临床疗效相关性低[25, 27-29]，因此，对 PARP 抑制剂基于酶活抑制发挥其抗肿瘤作用的机制提出了挑战。为此，Thomas Helleday 等提出了 PARP 捕获理论[15, 30, 31]，认为 PARP 抑制剂并不影响 PARP 酶与 DNA 损伤位点的结合，PARP 抑制剂抑制 PAR 聚合物形成造成 PARP 酶不能顺利脱离 DNA，其结果是 PARP 抑制剂不仅抑制了 PARP 酶的催化作用，而且失活的 PARP 蛋白形成空间位阻，阻碍 DNA 修复相关蛋白发挥作用或者影响发生在 DNA 上的其它事件，例如复制（图 1.2 B）。由此，使 DNA 单链修复失效，DNA 损伤蓄积，杀伤细胞[15, 30, 31]。然而上述理论难以解释 PARP 抑制剂的酶活抑制能力与其抗肿瘤作用相关性低的原因。随后，Pommier 等进一步发展出亚细胞蛋白组分分离方

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