细胞穿膜肽修饰的SN38前药及其siRNA共递送体系的抗肿瘤研究

发布时间：2020-07-09 14:28

【摘要】：恶性肿瘤是全球主要的致死疾病之一,严重威胁人类的健康。恶性肿瘤的临床治疗手段仍以手术和化疗为主。但化疗药物通常具有溶解性差、毒性大、不具有靶向性等缺点,限制其广泛的临床应用。本文建立了一种细胞穿膜肽(CPP)修饰的自包封前体药物及其共递送体系用于递送难溶性化疗药物。7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)是一种传统的抗肿瘤药物,具有广谱的抗肿瘤活性,但由于自身的理化性质、药理学特点和毒性限制,使其很难应用于肿瘤的临床治疗。本文以SN38作为模型药物,采用PEG与不同性质的CPP修饰SN38合成SN38前体药物(CPP-PEG-SN38)改善其溶解性、提高细胞摄取。这些SN38前体药物可以自组装形成胶束,聚乙二醇(PEG)对CPP的电荷屏蔽作用使这些胶束可以应用于体内抗肿瘤研究。与阳性对照伊立替康(CPT-11)相比,这些CPP-PEG-SN38胶束在细胞摄取、体内体外抗肿瘤活性、组织分布等方面具有显著的优势,并且优化出具有最优抗肿瘤活性的前体药物(TAT-PEG-SN38)。但CPP-PEG-SN38并未改善CPT-11对组织的毒性。Survivin siRNA可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为增强SN38靶向性、改善SN38抗肿瘤活性、降低SN38的组织毒性,本文建立了TAT-PEG-SN38与survivin siRNA的转铁蛋白(Tf)靶向脂质体共递送体系(Tf-L-SN38/P/siRNA)。Survivin siRNA与鱼精蛋白通过静电吸附构成脂质体核心;磷脂与TAT-PEG-SN38作为递送体系的中间层骨架;外层的Tf修饰为脂质体提供靶向能力。Tf-L-SN38/P/siRNA提高了survivin siRNA与TAT-PEG-SN38的抗肿瘤活性,并且与CPT-11相比,显著降低了组织毒性。本论文研究内容主要涉及以下几部分:1、CPP-PEG-SN38合成以PEG作为linker连接CPP与SN38,合成一系列CPP-PEG-SN38。采用三步法合成CPP-PEG-SN38:(1)合成5种C末端半胱氨酸修饰的CPP,5种CPP分别为R8、P28、PFV、SAP(E)和TAT。(2)以三光气作为酰氯化试剂,将SN38的C_(10)位羟基酰氯化后,与OPSS-PEG_(2000)-OH通过酯键连接。(3)反应产物中加入半胱氨酸修饰的CPP与OPSS基团反应形成二硫键,合成CPP-PEG-SN38。CPP-PEG-SN38自组装形成胶束,粒径为124 nm到249 nm,并具有相对较低的电位。2、CPP-PEG-SN38体外抗肿瘤活性评价通过激光共聚焦与流式细胞仪对CPP-PEG-SN38的细胞摄取定性、定量分析,CPP-PEG-SN38可以被细胞完整地摄取,CPP-PEG-SN38的细胞摄取依赖CPP的疏水性与正电荷,TAT-PEG-SN38具有最高的细胞摄取率,并且具有细胞核靶向性。采用细胞摄取抑制剂处理细胞,研究不同CPP-PEG-SN38的摄取机制,发现CPP-PEG-SN38主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。CPP-PEG-SN38的体外抗肿瘤活性与CPP的性质密切相关,CPP-PEG-SN38的细胞毒性与细胞摄取具有相似的趋势,并且CPP-PEG-SN38的细胞毒性具有时间、剂量依赖特性。在A549和MCF-7细胞中,TAT-PEG-SN38的细胞毒性分别为SN38的4.3、3.6倍。3、CPP-PEG-SN38体内抗肿瘤活性及毒性研究通过体外溶血实验对CPP-PEG-SN38的血液相容性进行分析,CPP-PEG-SN38并未引起溶血或者凝聚现象,可以通过静脉给药。建立裸鼠A459细胞异位荷瘤模型评价CPP-PEG-SN38体内抗肿瘤活性,系列CPP-PEG-SN38胶束均具有显著的抗肿瘤活性,TAT-PEG-SN38展现了最强的肿瘤生长抑制效果。与对照组和CPT-11给药组相比,TAT-PEG-SN38分别抑制73.6%和61.4%的肿瘤生长。体外、体内抗肿瘤实验证明:TAT-PEG-SN38具有最优的抗肿瘤活性。通过体重、脏器病理切片评价CPP-PEG-SN38的毒性。TAT-PEG-SN38的毒性与CPT-11相似,并未显著降低裸鼠体重。但脏器病理切片显示TAT-PEG-SN38会对裸鼠的肝脏、小肠造成损伤,损伤程度和CPT-11相近。4、TAT-PEG-SN38的药代动力学及组织分布建立血浆、组织中TAT-PEG-SN38、SN38和CPT-11的含量分析方法,研究大鼠给药TAT-PEG-SN38和CPT-11后的药代动力学,CPT-11的血药浓度显著高于TAT-PEG-SN38,TAT-PEG-SN38并未展现出抗肿瘤优势。建立裸鼠A549细胞荷瘤模型,分析TAT-PEG-SN38在裸鼠体内的组织分布。TAT-PEG-SN38在裸鼠肿瘤内大量积累,在肿瘤组织内TAT-PEG-SN38的AUC_(last)是CPT-11的37.5倍,TAT-PEG-SN38释放的游离SN38的AUC_(last)是CPT-11的8.7倍。通过裸鼠活体成像进一步分析TAT对TAT-PEG-SN38在肿瘤内累积的影响,实验结果证明:TAT可以促进SN38在肿瘤组织内累积,发挥更好的抗肿瘤活性。5、Tf-L-SN38/P/siRNA抗肿瘤活性评价SN38是一种具有广谱抗肿瘤活性的拓扑异构酶I(TOPⅠ)抑制剂。然而SN38具有溶解性差、副作用强等缺点,虽然将SN38合成TAT-PEG-SN38前体药物提高了抗肿瘤活性,但与CPT-11相比并未显著改善组织毒性。Survivin在肿瘤细胞高表达,survivin蛋白具有抑制细胞凋亡,促进血管生成等作用。Survivin siRNA可以提高肿瘤细胞对SN38的敏感性,增强SN38的抗肿瘤活性。本文建立了共递送survivin siRNA与TAT-PEG-SN38的靶向脂质体体系,以期提高TAT-PEG-SN38的抗肿瘤活性、降低组织毒性。Tf-L-SN38/P/siRNA的粒径为148 nm,ζ-电位为+7.8 mV。当鱼精蛋白与survivin siRNA通过静电吸附形成脂质体核心时,脂质体具有更好的siRNA结合效率。Tf-L-SN38/P/siRNA可以将survivin siRNA与TAT-PEG-SN38同步地、等比例地转载进入细胞,并且Tf与TAT-PEG-SN38显著增强了Tf-L-SN38/P/siRNA的细胞摄取。细胞摄取机制研究结果显示,Tf-L-SN38/P/siRNA主要通过转铁蛋白受体和网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。MTT实验中,survivin siRNA脂质体对HeLa细胞的细胞毒性不显著。在HeLa细胞中,Tf脂质体仅载药TAT-PEG-SN38时,细胞毒性是SN38的1.25倍;但当survivin siRNA与TAT-PEG-SN38联合给药时,细胞毒性提高至SN38的14.56倍。采用Western blot评价Tf-L-SN38/P/siRNA对survivin基因的沉默作用。Tf与TAT-PEG-SN38可以增加脂质体对survivin siRNA的递送效率,与survivin siRNA脂质体相比较,Tf-L-SN38/P/siRNA能显著抑制HeLa细胞表达survivin蛋白。建立HeLa细胞裸鼠荷瘤模型评价Tf-L-SN38/P/siRNA体内抗肿瘤效果。L-siRNA的抗肿瘤作用有限。Tf-L-SN38/P/siRNA具有最有效的抗肿瘤活性,与对照组相比肿瘤增长抑制率为76.8%;与Tf-L-SN38相比,Tf-L-SN38/P/siRNA与siRNA共同给药抑制了33.8%的肿瘤增长;与L-SN38/P/siRNA相比,Tf-L-SN38/P/siRNA在Tf靶向修饰后抑制了39.1%的肿瘤体积增长。并且Tf-L-SN38/P/siRNA给药后对肝脏、肾脏和小肠没有明显损伤。以L-SN38/P/siRNA作为对照,活体成像进一步评估Tf-L-SN38/P/siRNA在体内的靶向效率。Tf修饰后脂质体在肿瘤部位具有更高的靶向性。综上所述,本文建立了CPP修饰的自包封SN38前体药物及其共递送体系,并对其抗肿瘤活性进行评价,以期获得抗肿瘤活性高、毒性低的SN38递送体系。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
【图文】：

喜树碱类似物,化学结构

完全恢复而 DNA 合成功能只有部分恢复[8有 TOP Ⅰ靶向性，当 TOP Ⅰ基因发生突变时。喜树碱类化合物（CPTs）包括天然喜树碱]，具有广谱的抗肿瘤活性。CPTs 通过抑制 OP Ⅰ-DNA 形成中间复合体，抑制 DNA 的再形成三元复合物，不与 TOP Ⅰ或 DNA 单独导致 DNA 碎裂，诱导细胞凋亡[16, 17]。CP3,4-β）喹啉构成的六元环骨架（环 A，B）xy- -lactone（环 E）。在 C20具有一个手性中理活性是其同分异构体 20R-CPTs 的 10 ~ 1内酯环 E 和吡啶酮环 D 对拓扑异构酶抑制和 C10取代合成新的类似物，进而提高 CP于其强大的抗肿瘤活性引起了科学家的广泛

化学结构

瘤化合物 CPT 的一种半合成产物 C10位和 C7位分别通过乙基和羟基8 的分子量为 392.4 g/mol，在 25 °C 为 2.65[22]。SN38 几乎不溶于水（11剂中也难以溶解，SN38 仅在 0.5%解，因此限制了 SN38 的直接给药表明 SN38 在开环形式可以提高溶 pH 可逆水解，水解机制如图 1.3 所酯水解，当 pH 值为 7.4 时，SN38完全以内酯形式存在；但当 pH > 9.，两种形式的 SN38 处于等量的平活性，SN38 在生理条件下不稳定，

羧酸盐,内酯,依赖性

SN38 的内酯依赖 pH 可逆水解，水解机制如图 1.3 所示。手型中心 C20位的羟基可以促进 SN38 内酯水解，当 pH 值为 7.4 时，SN38 倾向于以羧酸盐存在；当 pH 值≤ 4.5，SN38 完全以内酯形式存在；但当 pH > 9.0 时，SN38 完全以羧酸盐存在；在 pH = 6.7 时，两种形式的 SN38 处于等量的平衡状态[22, 24]。羧酸盐形式的 SN38 不具有生理活性，SN38 在生理条件下不稳定，这是 SN38 提供有效治疗的一个主要障碍。图 1.2 SN38 的化学结构Figure 1.2 Chemical structure of SN38

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