RBP2吡啶类抑制剂的生物学功能研究

发布时间：2020-07-24 13:41

【摘要】：研究背景胃癌是最常见的恶性肿瘤,也是在肿瘤死亡率中排名前三的恶性肿瘤。我国胃癌患者的比例近些年在不断增加,占全球胃癌患者总数的比例超过40%,死亡率也明显高出其他国家。目前临床上对早期胃癌诊断的缺乏以及病人本身对自身胃部疾病的忽视,导致胃癌得到诊断时一般已经是中晚期,因此胃癌患者的五年生存率在5%以下。深入揭示胃癌的发生发展机制以及寻求新的具有临床使用价值的药物靶点至关重要。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hpylori)可引发萎缩性胃炎、非萎缩性胃炎和肠型胃癌,进而发展为弥漫型胃癌。幽门螺旋杆菌刺激上皮细胞,使中性粒细胞积聚,产生炎症介质、活性氧和氮物种,从而破坏胃黏膜上皮细胞,导致DNA损伤和细胞功能异变。针对作用对象不同,表观遗传调节可以分为对DNA、组蛋白、Non-coding RNA和染色质的调控。表观遗传调节因子的异常与人类疾病包括炎症性疾病、代谢紊乱、神经系统疾病和癌症等息息相关,相关致病机制不断被阐明揭示。目前针对表观基因组调节因子的小分子抑制剂的研究越来越广泛深入,并且在临床上已有去乙酰化酶抑制剂和DNA甲基转移酶抑制剂被批准用于应用,更多针对调控表观遗传的药物前体正在临床试验中。RBP2属于组蛋白去甲基化酶KDM5家族,具有JmjC结构域,通过辅因子Fe(Ⅱ)和α-Ketoglutaricacid(α-KG)的双加氧酶反应使组蛋白H3上的二甲基化和三甲基化赖氨酸4去甲基化。根据目前已有文献证明,RBP2参与肿瘤细胞的许多生物学功能过程,包括增殖、迁移、侵袭、凋亡及自噬等过程,在胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、白血病等疾病的发生发展中起重要作用;RBP2的高表达还与肿瘤患者预后不良紧密相关。本课题组已经证明RBP2能够促进幽门螺旋杆菌介导的胃黏膜上皮细胞恶性转化与侵袭转移。综上所述,针对在幽门螺旋杆菌所介导的胃炎到胃癌的恶性转化中起关键作用的调控分子RBP2设计阻断剂,可以为胃癌的早期预防和靶向治疗提供新选择。研究目的以药效团己胺甲酰基片段为核心,设计合成特异性抑制组蛋白去甲基化酶RBP2活性的小分子化合物,筛选获得潜在抑制RBP2酶活性的小分子化合物药物前体,并在胃癌模型中进行相关的生物学功能验证,为临床针对RBP2所致疾病的治疗提供更多的选择。研究方法与结果1.化合物WXSA-055B通过抑制RBP2能促进胃癌细胞BGC-823中H3K4me3的表达,并调控RBP2下游靶基因。使用Western-blot,检测化合物WXSA-055B在人体胃癌细胞BGC-823中对RBP2、组蛋白H3K4me3 水平、以及RBP2下游靶基因p21、p27、CCND1的表达。结果显示WXSA-055B能够抑制人胃癌细胞BGC-823中RBP2的表达,并使RBP2组蛋白去甲基化酶活性功能受到抑制,促进酶底物H3K4me3的表达升高,同时调控RBP2下游靶分子产生相对应的变化。同时通过EdU实验和Transwell小室检测,结果表明化合物WXSA-055B不调控BGC-823的增殖和迁移功能。2.化合物WXSA-059A下调胃癌细胞BGC-823中RBP2蛋白水平,调控RBP2下游靶基因,抑制细胞的增殖。对胃癌细胞BGC-823进行化合物WXSA-059A处理,使用Western-blot检测RBP2、H3K4me3、p21、CCND1的变化,同时通过EdU实验检测细胞的增殖能力。实验结果表明,化合物WXSA-059A能够调控RBP2及其下游靶基因,从而显著降低BGC-823细胞的增殖能力。3.化合物WXSA-051B抑制RBP2表达,促进RBP2酶活性底物H3K4me3表达增加,促进BGC凋亡相关蛋白的表达,抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。对胃癌细胞BGC-823进行化合物WXSA-051B处理后,检测细胞的蛋白以及生物学功能变化。实验结果表明,化合物WXS-051B处理后,BGC-823细胞中RBP2表达下降,H3K4me3水平、Caspase-3表达上升。同时对处理后的细胞进行增殖EdU检测、流式分析以及Transwell小室检测发现,化合物WXSA-051B处理后,BGC-823细胞的增殖和迁移能力均受到明显抑制,但细胞凋亡情况未发生改变。4.化合物WXSA-082B抑制RBP2并调控其下游,上调RBP2酶底物H3K4me3水平,促进凋亡相关蛋白表达增加,抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。对胃癌细胞BGC-823进行化合物WXSA-082B处理后,检测相应蛋白变化以及生物学功能验证。实验结果表明,化合物WXS-082B处理后,BGC-823细胞中RBP2表达下降,H3K4me3、Caspase-3、PARP1表达上升。同时处理后的细胞进行增殖EdU检测、流式分析以及Transwell小室检测发现,化合物WXSA-082B处理后,BGC-823细胞的增殖能力和迁移能力明显降低,但细胞凋亡无显著变化。5.化合物WXSA-072A抑制胃癌BGC-823细胞中RBP2表达,促进RBP2酶活性底物H3K4me3水平上升,促进BGC-823凋亡相关蛋白的表达和胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。对胃癌细胞BGC-823进行化合物WXSA-072A处理后,检测相应蛋白变化以及功能验证。实验结果表明,化合物WXS-072A处理后,BGC-823细胞中RBP2表达减少,H3K4me3水平和Caspase-3表达上调。同时处理后的细胞进行增殖EdU检测、流式分析以及Transwell小室检测发现,化合物WXSA-072A处理后,BGC-823细胞的增殖和迁移能力受抑制,凋亡细胞显著增多。研究结论1.化合物WXSA-055B仅在蛋白水平对RBP2表达及其调控的H3K4me3水平有所影响,进而导致胃癌细胞中RBP2的下游靶分子表达变化,但并不影响细胞的生物学功能;2.化合物WXSA-059A在蛋白水平影响RBP2及其下游靶分子,可以抑制胃癌细胞的增殖能力,但不抑制RBP2去甲基化酶作用;3.化合物WXSA-051B与WXSA-082B在蛋白水平调控RBP2和RBP2酶底物H3K4me3水平,并且影响其下游靶分子,抑制胃癌细胞增殖和迁移能力;4.化合物WXSA-072A在蛋白水平调控RBP2及其酶底物H3K4me3水平,影响RBP2的下游靶分子,从而抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力,促进胃癌细胞发生凋亡。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914

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